间充质干细胞体外培养方法改良及其诱导调节性树突状细胞的机制

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1、类号：R446.63学校代码：10062密级：学号：2012602126硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：间充质干细胞体外培养方法改良及其诱导调节性树突状细胞的机制TITLEImprovementofin-vitroculturemethodofmesenchymalstemcellsandmechanismofinducingtolerogenicdendriticcells一级学科：临床医学二级学科：临床检验诊断学论文作者：贺鑫指导教师：刘运德天津医科大学研究生院二O

2、一五年五月分类号：R446.63学校代码：10062密级：学号：2012602126学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：间充质干细胞体外培养方法改良及其诱导调节性树突状细胞的机制TITLEImprovementofin-vitroculturemethodofmesenchymalstemcellsandmechanismofinducingtolerogenicdendriticcells一级学科：临床医学二级学科：临床检验诊断

3、学论文作者：贺鑫指导教师：刘运德导师组成员：李雪鲍会静天津医科大学研究生院二O一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论

4、文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的：间充质干细胞是一种具有自我复制和多向分化潜能的干细胞。其在临床上应用广泛，可用于治疗GVHD（Graft-versus-hostdisease）、促进造血重建等。此外，间充质干细胞还可以抑制异种抗原刺激

5、所致的淋巴细胞反应、促进调节性T细胞生成等，具有广泛的免疫调节作用。并且，近期研究发现，其不但对特异性免疫应答具有重要的调节作用，对非特异性免疫应答细胞亦具有调节作用。研究发现，其可能参与“调节性树突状细胞”的形成，但是目前对其作用机制尚不明确。间充质干细胞已成为干细胞领域研究的重点，具有广阔的应用前景，但是目前常用的体外培养间充质干细胞的方法容易导致其干性降低、细胞凋亡以及衰老。因此，本课题拟寻找一种可以维持间充质干细胞干性，降低其凋亡、延缓衰老进程的培养方法；并对其与树突状细胞之间相互作用的机制

6、进行初步探讨。方法：将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养板表面，在60℃烘箱中完全烘干，形成壳聚糖薄膜。后将分离出的小鼠骨髓间充质干细胞以同等密度接种于涂覆有壳聚糖的培养板和普通未经处理的培养板上，培养5天后收集两组细胞检测其干性相关标志分子CD44、Sca-1的表达情况；分别用PI-AnnexinV和Hochest33342进行染色和标记，用流式细胞仪和荧光显微镜分析和观察细胞凋亡的情况；最后用β-Gal细胞衰老染色试剂盒进行染色，在光学显微镜下观察细胞的衰老情况。通过上述实验分析三维球体培养方式对间充

7、质干细胞干性、凋亡和衰老的影响。为了研究间充质干细胞与树突状细胞之间相互作用的机制，我们收集生长状态良好的间充质干细胞培养上清，从中分离出外泌体并添加到树突状细胞的培养基中，通过ELISA的方法检测树突状细胞分泌的IL-10的情况。将与外泌体共培养48h后的树突状细胞与小鼠淋巴细胞共培养72h，之后用流式细胞仪分析淋巴细胞中CD4+CD25+细胞即调节性T细胞的比例以及分析T细胞增殖能力的变化。通过对树突状细胞分泌IL-10以及其激活T细胞能力的变化进行分析，探讨外泌体是否参与间充质干细胞对树突状细

8、胞的调节。结果：间充质干细胞在壳聚糖薄膜上培养1天即开始出现聚集的趋势，到第3天即呈半悬浮的三维球体状态。通过各个实验结果发现：三维球体状态下生长的间充质干细胞其干性相关分子CD44和Sca-1的表达比例要明显高于对照组，很好的保持了其干性；流式细胞仪结果显示的凋亡细胞比例以及在荧光显微镜I下观察的凋亡情况表明，三维球体的培养状态很好的延缓了细胞的凋亡；光学显微镜下观察β-Gal染色结果可以看出，对照组细胞明显比三维球体培养的细胞更早的出现了衰老。将生长状态良好的间充