特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定

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1、特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定作者：许静吴立华徐洁刘俊霞孟磊何一心宋增璇【摘要】目的：从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离和鉴定抗造血干/祖细胞表面分子单链抗体（scFv），克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法：用完整的KG1a细胞吸附法富集文库3轮，再用CD44单克隆抗体为引导分子进行引导选择，分离单克隆后用间接免疫荧光法鉴别其细胞结合特异性。对具有不同细胞结合特异性的克隆进行DNA序列分析，用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹鉴别抗原分子量。结果：间接免疫荧光结果显示，64个阳性克隆分别识别不同的细胞系，分属3种细胞

2、结合谱，DNA序列测定结果证明C95、H1两个克隆具有独特的一级结构，利用ethods:AnindividualKG1a+phagescFvlibraryforthebindingspecificitytoEighthematopoieticprogenitorcelllinesbyindirectimmunoflurorescEInonoclonalityofthescFvsarystructuresoftKG1acellsolecularethodstoidentifyphagescFvclonesagainstcellsurfacemo

3、leculeshavebeenestablishedandobtainedtatopoieticprogenitorcellsurfacemoleculesfromanantiKG1acellphagescFvlibrary.［Keyolecule;ScFv　　免疫球蛋白的可变区是抗体识别和结合抗原的功能区，其分子量只有全抗体的1/5左右，由于分子量小、组织穿透力强，因此由抗体可变区构成的单链抗体（Singlechainantibodyfragments,scFv）具有体内良好的应用前景，也是构建成各种双功能抗体的基本单位[1]。近年快速发展

4、的噬菌体表面展示抗体技术日益成为制备单克隆抗体的有效手段，如何从包含众多非特异性和未知特异性的文库中分离特异性单克隆phagescFv，涉及到筛选策略选择和多项技术的应用。本研究的目的在于寻找新的有功能的抗造血干/祖细胞表面分子的抗体，并通过所获得的抗体分离抗原分子及其基因，我们探索了从自建的噬菌体抗体库中分离和鉴定特异性单克隆phagescFv的方法，对分离的特异性单克隆scFv进行表达鉴定，这对于进一步研究抗造血/干祖细胞表面分子和发现新的细胞表面分子具有一定的意义[2]。　　1材料与方法　　1.1材料　　抗KG1a细胞噬菌体展示文库由本

5、室构建[3]；NHS生物素和链霉亲和素磁珠购自Pierce公司；抗M13单抗购自pharmacia公司；抗CD44单抗和兔抗小鼠IgGFITC购自协和干细胞公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠F(ab)2{HRPF(ab)2}购自ProtosImmunoresearch公司；表达载体pSTE2、辅助噬菌体M13KO7和E.coliXL1Blue由德国海德堡大学Dubel博士惠赠；HL60、U937、CEM、Jurkat、NALM6、BJAB、HEL、Meg01等细胞系由本室保存备用；限制性内切酶、连接酶等购自Invitrogen公司。　　

6、1.2phagescFv文库的富集和引导选择　　参见　　2.2KG1a+phagescFv单克隆对其他细胞系的识别　　64个阳性单克隆分别与8个造血祖细胞阶段细胞系做间接免疫荧光反应，其中41个单克隆与8个细胞系均呈阳性反应，15个单克隆识别7个细胞系而不识别BJAB细胞系，8个单克隆与8个细胞系均呈阴性反应（表1）。结果显示有3种类型scFv，它们的细胞结合谱为9（+）、8（+）1（-）和1（+）8（-）。表1phagescFv的细胞结合谱（略）　　2.3phagescFv单克隆的DNA序列分析　　从与细胞结合谱不同的phagescF

7、v中分别挑取2个克隆作DNA序列测定。测序结果按Kabat编号标明scFv核苷酸排列顺序及其演绎的氨基酸残基排列顺序，比较各个scFv的互补决定区（CDR）[6]。结果3个克隆的DNA序列与以前报导的C4、C131和C193相同；1个克隆的互补决定区与以前报导的C194相差2个氨基酸残基；2个克隆C95、H1的DNA序列完全不同于以前报导（表2，3）[4]。表2scFv克隆的重链互补决定区氨基酸残基序列（略）表3scFv克隆的轻链互补决定区氨基酸残基序列（略）　　2.4免疫印迹结果分析　　免疫印迹结果显示scFvSAC95和scFvSAH

8、1融合蛋白能识别和结合KG1a细胞膜蛋白中的抗原带，它们的表观分子量分别约为34、22kD（图2）。　　3讨论细胞表面分子是鉴别细胞种类