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时间:2018-07-10
《抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、抗人β?淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定段朝晖,毛越苹,罗晓红,李民友,劳伟思,王英,朱振宇【摘要】目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β?淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,转化至大肠
2、杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS?PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT?PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×108的噬菌体抗体库,经SDS?PAGE鉴定,得到Mr约为30000ku,纯度较好的ScFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异
3、性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.【关键词】噬菌体展示技术;单链抗体;阿尔茨海默病;β?淀粉样肽 【Abstract】AIM:Toconstructandidentifythespecificanti?humanβ?amyloidpeptideScFvbyphageantibodylibrarydisplaysystem.METHODS:TotalRNAspleenBcellsofBALB/cmiceimmunizedyloidpept
4、ide,andmRNAthetotalRNA,thenthefirst?strandcDNAentsplifiedbyprimaryPCRandtheamplifiedVHandVLPCRfragmentsbledScFvgenefragmentsplifiedandrestrictionsitesentsidspCANTAB5EandthephagemidscontainingScFvgeneedintopetentE.coliTG1cells.Thetransformedcellsidsmunep
5、hageScFvlibraryentsamplifiedbyprimaryPCRatchedtheexpectancyofVHandVLgenefragments.ThepurifiedVHandVLPCRfragmentsidmunephageScFvlibraryolecularmunephageScFvlibraryissuccessfullyconstructed.Thesuccessfulpreparationofanti?AβScFvechanism,diagnosisandtreatme
6、ntofpatientser?sdisease. 【Key;singlechainvariablefragment;Alzheimer?sdisease;β?amyloidpeptide 0引言 阿尔茨海默病(alzheimer?sdisease,AD),又称早老性痴呆症,是一种以记忆丧失、行为失常、人格改变、思维能力下降和认知功能障碍等为特征的中枢神经系统退行性疾病.有研究报道β?淀粉样肽(β?amyloidpeptide,Aβ)与AD的发病直接相关[1-2].目前国内仅有制备Aβ42多克隆抗
7、体的相关工作,有关建立良好的血液标志物检测方法的研究报道还较少见.本实验通过噬菌体抗体库技术[3-4]构建抗Aβ的单链抗体库,为检测血液或脑脊液中Aβ水平并用于诊断AD[5-6]和抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定以及临床治疗应用打下基础. 1材料和方法 1.1材料雌性BALB/c纯系小鼠20只,6~7entas公司);鼠ScFv噬菌体抗体展示系统(瑞典Amershampharmacia公司);Trizol试剂(美国Gibco公司);DNA多聚酶,QIAquickPCR纯化试剂盒(荷兰Qiag
8、en公司);SfiI内切酶,NotI内切酶(美国NEB公司);T4DNALigase(美国Invitrogen公司);Aβ(美国Americanpeptide公司). 1.2方法 1.2.1动物免疫将0.5mL的Aβ42(150mg/L)与等量的完全福氏佐剂混合乳化,直到油包水的状态,取5只小鼠用Aβ42进行免疫.第一次基础免疫:每只小鼠自后足垫注射0.1mL.基础免疫后2L,共加强免疫2次.45d后引颈法处死免疫小鼠,取其脾脏. 1.2.2总RN
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