特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定

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1、特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定作者：许静吴立华徐洁刘俊霞孟磊何一心宋增璇【摘要】目的：从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离和鉴定抗造血干/祖细胞表面分子单链抗体，克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法：用完整的KG1a细胞吸附法富集文库3轮，再用CD44单克隆抗体为引导分子进行引导选择，分离单克隆后用间接免疫荧光法鉴别其细胞结合特异性。对具有不同细胞结合特异性的克隆进行DNA序列分析，用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹鉴别抗原分子量。结果：间接免疫荧光结果显示，64个阳性克隆分别识别不同的细胞系，分属3种细胞结合谱，DNA序列测定结果证明C95、H

2、1两个克隆具有独特的一级结构，利用Westernblot成功测定它们特异性识别KG1a细胞膜蛋白的表观分子量分别为34kD/22kD。结论：成功建立了分离和鉴定抗细胞表面分子phagescFv单克隆的方法，并从抗KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离出2个抗造血干/祖细胞的特异性克隆。【关键词】噬菌体展示引导选择表面分子单链抗体Isolationandidentificationofspecificsingle10/10chainantibodiesagainstcellsurfacemolecules［Abstract］Objective:Isolationandident

3、ificationofsinglechainantibodiesagainstsurfacemoleculesofhematopoieticprogenitorcellsviaphagedisplayantibody:AninpidualKG1a+phagescFvlibraryforthebindingspecificitytoeighthematopoieticprogenitorcelllinesbyindirectimmunofluroresceinwereidentified.Then,themonoclonalityofthescFvswasprovedbyt

4、estingspecificbindingtoantigenproteinsbyWestern:64KG1a+phagescFvswereidentified.Theyshowedthreekindsofcellbindingrepertoire.TheuniqueprimarystructuresoftwophagescFvcloneswereprovedbyDNAsequence.TheirrecombinantscFvSAfusionproteinsboundtothesinglebandofproteinsfromKG1acellswithmolecularw

5、eightsof34kDand22kD,:ReliablemethodstoidentifyphagescFvclonesagainstcellsurfacemoleculeshavebeenestablishedandobtainedtwouniquephage-scFvclonesagainsthematopoieticprogenitorcellsurfacemoleculesfromanantiKG1acellphagescFvlibrary.10/10［Keywords］Phagedisplay;Pathfinderselection;Surfacemole

6、cule;ScFv　　免疫球蛋白的可变区是抗体识别和结合抗原的功能区，其分子量只有全抗体的1/5左右，由于分子量小、组织穿透力强，因此由抗体可变区构成的单链抗体具有体内良好的应用前景，也是构建成各种双功能抗体的基本单位[1]。近年快速发展的噬菌体表面展示抗体技术日益成为制备单克隆抗体的有效手段，如何从包含众多非特异性和未知特异性的文库中分离特异性单克隆phagescFv，涉及到筛选策略选择和多项技术的应用。本研究的目的在于寻找新的有功能的抗造血干/祖细胞表面分子的抗体，并通过所获得的抗体分离抗原分子及其基因，我们探索了从自建的噬菌体抗体库中分离和鉴定特异性单克隆phage

7、scFv的方法，对分离的特异性单克隆scFv进行表达鉴定，这对于进一步研究抗造血/干祖细胞表面分子和发现新的细胞表面分子具有一定的意义[2]。　　1材料与方法材料10/10抗KG1a细胞噬菌体展示文库由本室构建[3]；NHS生物素和链霉亲和素磁珠购自Pierce公司；抗M13单抗购自pharmacia公司；抗CD44单抗和兔抗小鼠IgGFITC购自协和干细胞公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠F2{HRPF2}购自ProtosImmunoresearch公司；表达载体pSTE2、辅助噬菌体M13KO7和XL1