人骨髓间充质干细胞对异体外周血t淋巴细胞的抑制作用及机制论文

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1、人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制论文白海司志刚王存邦薛智文吴涛杨小亮【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制.方法：从骨髓中分离培养MSCs，反复贴壁进行纯化；用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞；观察MSCs对植物血凝素（PHA）刺激下T淋巴细胞增殖的影响，用ELISA方法检测IFNγ，IL4水平变化.结果：MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用，并呈剂量依赖性；同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFNγ分泌，但可促进IL4

2、的分泌.结论：MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFNγ和IL4有关.【关键词】骨髓间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫调节；干扰素γ；白细胞介素40引言骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是骨髓中不同于造血干细胞的另一类成体干细胞.freelL（n=10），DMEM（Gibco）倍比稀释，Ficoll分离液（天津灏洋）2000r/min,15min条件下分离出单个核细胞，DMEM洗涤2次，完全培养基（100g/L胎牛血清+DMEM）

3、重悬细胞，以2×109/L接种于25cm2培养瓶内，37℃，50mL/LCO2孵箱内培养，24h首次换液，以后每2～3d换液1次，细胞融合度达80%时消化传代培养，流式细胞仪分析检测传至3代MSCs的纯度.1.2外周血T淋巴细胞的分离与纯度鉴定取新鲜肝素抗凝人外周血20mL，Ficoll分离液（2000r/min,15min）分离出单个核细胞，尼龙棉柱法进一步分选T淋巴细胞，流式细胞仪分析尼龙棉柱分离前后T淋巴细胞的纯度.1.3MSCs对植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA）作用下的T淋巴细

4、胞增殖的影响取第3代培养的MSCs，经60Co照射30Gy，调整细胞密度，按细胞数分为3组，A组1×103个，B组1×104个，C组1×105个，每组设单独同等数量MSCs为空白对照，以单独T淋巴细胞培养为阳性对照.以终体积100μL／孔，加入96孔培养板内，MSCs完全贴壁后吸去上清或更换培养液，并除空白对照外各组加入T淋巴细胞1×104/孔.经PHA5μg（Sigma）作用68h后加入20μL／孔MTT（Sigma）继续孵育4h，弃上清后二甲基亚砜固定，酶标仪490nm处测定A值，增殖百分率=（实验组A值-

5、对照组A值）/实验组A值.1.4MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞IFNγ，IL4分泌的影响分别用1×107/L，1×108/LMSCs与1×109/L的T淋巴细胞共培养，同时加入5μg的PHA.应用IFNγ，IL4试剂盒（武汉博士德）检测各组培养上清中IFNγ和IL4浓度.统计学处理：应用SPSS软件进行统计分析，实验结果用x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Duntt检验，P0.05为有统计学差异.2结果2.1MSCs与T淋巴细胞纯度鉴定原代MSCs形态均匀一致，呈长梭形，流式细胞

6、仪结果显示：传至3代MSCs高表达CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或极低表达，纯度达90%以上；异体外周血单个核细胞经尼龙棉柱分离后CD3+细胞百分比达98%以上.2.2MSCs抑制T淋巴细胞的增殖MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞增殖呈抑制效应，并呈剂量依赖性.单纯RPMI1640培养基条件下，T淋巴细胞阳性对照组的增殖率为（77.05±1.94）%，A，B，C组依次为（44.94±5.84）%，（33.45±7.00）%，（17.64±4.59）%，与阳性对照组比较均有统计

7、学差异（P0.05）.2.3MSCs抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ为（79.16±13.40）ng/L，与1×107/L，1×108/L的MSCs共培养时IFNγ的分泌分别为（25.54±7.05），（9.55±3.60）ng/L，IFNγ分泌明显减少（P0.05）.2.4MSCs促进T淋巴细胞IL4的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量为（46.04±9.67）ng/L，加入1×107/L，1×108/LMSC

8、s后，IL4的分泌增加，分别为（67.10±11.44），（97.92±19.48）ng/L，与单纯T淋巴细胞培养组比较差异具有统计学意义（P0.05）.3讨论MSCs是骨髓中的一类成体干细胞，是造血微环境的主要细胞成分，能分泌多种细胞因子，在维持造血微环境的稳定中起重要作用［1］.在特定条件下具有向脂肪细胞、成纤维细胞、成骨细胞等多系分化的能力［2］.目前研究发现，骨髓MSCs还具