一株抗菌活性物质产生细菌的分离及鉴定

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1、一株抗菌活性物质产生细菌的分离及鉴定殷杰，王蒙，曾小波，马志勇，程国军（中南民族大学生命科学学院，武汉４３００７４）摘要：从根际土壤分离到一株细菌ＣＹ０４，通过电镜观察和１６ＳｒＤＮＡ序列分析，发现该菌株同已知菌枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）的相似度最高，为９９％，初步认定为枯草芽孢杆菌。抑菌试验结果表明，该菌株对金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）有一定的抑菌活性，对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）和枯草芽孢杆菌没有抑菌活性。培养４８ｈ左右是其产生抗菌活性物质的最佳时期。

2、..关键词：根际土壤；枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）；鉴定；抑菌活性中图分类号：Ｑ９３６文献标识码：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０３４６－０３ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０２２随着有害生物耐药性问题的加剧，微生物产生的活性成分物质在人类疾病防治、动物医药保健、植物抗病害及食品防腐等方面表现出巨大的应用潜力。枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）通过产生多种抗菌代谢产物，能有效抑制病原菌并促进动植物生长，具有较高的工业、农业以及医

3、药应用价值［１］，同时，枯草芽孢杆菌也被认为是潜在的益生菌［２］。目前已知枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，包括细菌素、脂肽类抗生素以及酶类、蛋白类抑菌物质等［３］。从枯草芽孢杆菌中分离的Ｆｅｎｇｙｃｉｎ能够抑制多种重要植物病原真菌的生长［４］。本研究从根际土壤样品中分离到一株能产生抗菌物质的细菌ＣＹ０４，并根据形态学特征和１６ＳｒＤＮＡ基因序列对其进行了鉴定，初步认定其为枯草芽孢杆菌，同时对它的拮抗情况及产生原因进行了探讨。１材料与方法１．１抗菌活性物质产生菌种的筛选在带有玻璃珠的三角瓶中加入根际土样１ｇ和９９ｍＬ蒸馏水

4、，放置于２８℃摇床内振荡３０ｍｉｎ，取样做梯度稀释后，用其涂布牛肉膏蛋白胨平板，置于３７℃生化培养箱中培养４８ｈ，从中分离出细菌单株；以金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）为检测菌，采用纸片法进行菌株筛选，并对产生活性物质进行验证试验。１．２ＣＹ０４细菌的个体形态和电镜观察在ＬＢ平板上观察菌落形态，利用革兰氏染色法在油镜下观察菌体形态。将菌株用戊二醛固定，ＰＢＳ洗涤和梯度乙醇脱水，真空冷冻干燥机干燥，扫描电镜观察、拍照。电镜放大倍数１５０００。１．３ＣＹ０４细菌１６ＳｒＤＮＡ基因序列测定和系统进化分析

5、用ＬＢ培养基摇床培养菌体至对数期，离心后收集菌体，抽提细菌基因组的总ＤＮＡ。以ＣＹ０４菌株基因组ＤＮＡ为模板扩增１６ＳｒＤＮＡ基因片段［５］。扩增引物选用细菌通用ＰＣＲ引物１６Ｓ－Ｆ（５′ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ３′）、１６Ｓ－Ｒ（５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３′）。扩增程序为，９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３０次循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶回收，克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体［宝生物工程（大连）有限公司］，经酶切和ＰＣＲ验证后

6、，送北京擎科新业生物技术有限公司测序。序列提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行同源性比较分析。采用Ｂｉｏｅｄｉｔ和ＭＡＧＥ４．０软件以邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统进化树［６］。１．４菌株ＣＹ０４对不同指示菌拮抗能力的测定以大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为指示菌，采用牛津杯（内径６ｍｍ，外径８ｍｍ）法测定菌株ＣＹ０４对不同指示菌拮抗能力［７］。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，３７℃、２０ｒ／ｍｉｎ培养２４ｈ。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每个平板的中央置一个已灭

7、菌的牛津杯，吸取指示菌菌悬液在平板上均匀涂布，待平板晾干后进行抑菌试验。将ＣＹ０４菌株培养液离心，取上清液加入到牛津杯中，３７℃恒温培养箱中培养４８ｈ，观察生长情况并测量抑菌圈直径。将活化后的菌株ＣＹ０４按２％的接种量接入牛肉膏蛋白胨培养液中，每隔６ｈ取菌液离心，将上清液加入到牛津杯中，测定其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，确定产生活性物质的最佳时期。１．５菌株ＣＹ０４的抗性测定以抗生素卡那霉素（Ｋｍ）、氨苄青霉素（Ａｐ）、链霉素（Ｓｔｒ）、四环素（Ｔｃ）、庆大霉素（Ｇｍ）、氯霉素（Ｃｍ）、壮观霉素（Ｓｐｅ）为抗生活性物质，

8、测定菌株ＣＹ０４对抗生活性物质的抗性。将菌株ＣＹ０４接种到ＬＢ培养液中，３７℃摇床培养过夜。按２％的接种量将菌株接种于含不同浓度抗生素的ＬＢ液体培养基中，３７℃摇床（２００ｒ／ｍｉｎ）振荡培养４８ｈ，测定含各种不同浓度抗生活性物质菌液的吸光度，分析菌株ＣＹ０４生长情况。２结果与分析２．１菌株ＣＹ０４筛选