一株抗菌海洋放线菌的分离鉴定及其活性成分的初步研究

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1、西北农林科技大学硕士学位论文一株抗菌海洋放线菌的分离鉴定及其活性成分的初步研究姓名：原居林申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：王高学20080601一株抗菌海洋放线菌的分离鉴定及其活性成分的初步研究摘要本研究以辽宁、山东、浙江、福建、广西等地采集的海泥样品中分离、纯化获得的放线菌为供试菌，嗜水气单胞菌(彳P阳历D嬲幻访印Ill妇，编号ST78．3．3)、肠型点状产气单胞菌(彳绷聊D麟p堋c^砒If：血Stestin碰s，编号Ⅺ’91．4．1)、鳗弧菌(m，．如绷蹦f，7口Ⅲ坍，编号E．3．11)、杀鲑气单胞菌(彳伽历D疗甜阳砌伽埘口)、哈维弧菌(玢6，．勋加n，秒)、大肠杆菌

2、(西幽P砌砌∞疗)和金黄葡萄球菌(&q胡，D∞∞淞口“陀螂)为指示菌，采用琼脂扩散法和平板孔阱扩散法，筛选出一株具有抗菌谱广、活性较强的放线菌FA-F．5。通过多相分类法鉴定、水产动物疾病治疗试验、对鲫鱼免疫功能的影响试验、FA-F．5发酵条件优化试验、抗菌活性物质稳定性试验以及对抗菌活性物质的初步分离进行了研究，得到如下结论：lFA．F．5的分离鉴定：通过对FA．F．5的16SrDlNA序列测定，与蛐ank数据库中的16SrDNA序列进行比对，其同弗氏链霉菌mfo叼棚s．历动踟)的相似率达到99．5％；系统进化树分析表明二者之间的进化距离相隔较近；结合放线菌FA．F．5的形态特征、

3、培养特征及生理生化特性，将其确定为弗氏链霉菌(勋印幻叼傥J．所破钟)。2lIA．F．5发酵液生物治疗试验：以嗜水气单胞菌感染健康鲫鱼，投喂含有抗菌活性物质的药饵，当饲料中抗菌物质用量达到370姚·d时，鲫鱼没有发病，解剖内脏器官划平板无嗜水气单胞菌，证明该活性物质在生物体内具有较好的抗菌效果；分别以最佳治愈剂量的5倍量和10倍量饲喂鲫鱼，其内脏和体表未表现任何毒理现象，说明该活性物质对鲫鱼无急性毒性。3IIA．F．5发酵液对鲫鱼免疫功能影响试验：FA．F．5发酵液经浓缩制饵投喂鲫鱼，连续投喂14d，分别于Od，7d，14d检测鲫鱼吞噬细胞杀菌活性和血清凝集抗体效价，以研究该抗菌活性成

4、分对鲫鱼免疫功能的影响。结果表明，试验组吞噬细胞杀菌活性和血清凝集抗体效价与对照组相比存在显著性差异口<0．01)，证明该抗茵活性成分能增强鲫鱼的免疫功能。4FA．F．5发酵优化试验：应用正交试验对海洋放线菌FA．F．5的发酵条件进行优化，确定其最佳培养基配方为：麦芽糖159／L、黄豆粉25g／L、CaC031g／L、KH2P04O．5g／L、MgS04·7H200．5g／L、海盐lOg／L，最佳发酵条件为：发酵培养基初始pH7、发酵温度为25℃、种子液菌龄为48h、接种量为125龇、装样量为100m、发酵时间为96h。最佳发酵条件下发酵液抗菌活性相对于庆大霉素和环丙沙星的效价分别为

5、为2815n胁I。和61．43mg／L。5FA．F．5抗菌活性成分稳定试验：分别对发酵液进行不同温度、pH、光照强度、储存时间等处理，测定处理前后发酵液的抗菌活性的变化。试验结果证实在处理前后发酵液中的抗菌活性成分的抑菌圈直径未发生变化，说明其具有较强的热稳定性、酸碱稳定性，光稳定性和贮藏稳定性。6抗菌活性物质的初步分离纯化：FA．F．5发酵液经离心浓缩、732型树脂吸附、聚酰胺柱层析、醇沉，获得抗生素粗品。经碘化铋钾薄层显色试验证明该抗生素粗品属于氨基环醇类抗生素。本试验获得的具有抗菌活性的放线菌，对于微生物资源的开发利用具有重要意义。同时对海洋放线菌FA．F．5分类地位、发酵液生

6、物有效性、发酵条件优化及活性物质的初步分离纯化进行了初步研究，以期为开发水产专用的放线菌生物渔药提供基础资料。关键词：抗菌；海洋放线菌；活性成分ISoLATIoNANDIDENTIFICATIoNOFoNE．ANTIMICROBIALMARINE彳C乃!：ND黝哩CEZ冱STRAINANnELEMENTARYSTUDYoNITSACTIVESUBSTANC-E—一ABSTRACTTbis血esisw嬲缸edt0isolate口c砌2口彻心P，船缸吼也eSeamuds锄ples，w11ichc锄e舶mLi砌羔---霎鬻；l!茗各l鋈雾菱；薹蠹嚣矛誓丑霪姜寒繁霎耋譬_夔西塞哩塑葫奏嚣鼋萤

7、塞誓雾主瑟。蠢兰饕掣跚il已霎tl蔫强眩li蠹霎!}cknchtacoli口ndst叩h10cocc懈础retls啦舛豳aqsc舱e血gph硒e，and璐eexcava缸g-apcrtmebio髂sayteStateX缸lin撕∞p_llase．onehigh锄tibacte】jals廿ainFA-F-5w鹤choosen．Theconcl砸io璐、Ⅳe∞gai∞d鹊bclowbythepolyph嬲ictaxon(聊ly，thebiotll唧ytest，