资源描述：
《蝎毒纤溶活性肽预处理对缺氧血管内皮细胞抗凝和纤溶功能的影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、蝎毒纤溶活性肽预处理对缺氧血管内皮细胞抗凝和纤溶功能的影响论文【摘要】目的应用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧模型,探讨蝎毒纤溶活性肽(SVFAP)对缺氧损伤内皮细胞的保护作用。方法对培养的HUVECs传代并分组：对照组常规培养;缺氧组将其放入含95%N2、5%CO2混合气体的缺氧环境中培养12h,制备HUVECs缺氧损伤模型;药物干预组分别将终浓度为2，4，8mg/L的SVFAP加入细胞培养液中进行培养，1h后进行缺氧模型复制。观察各组细胞培养上清液中漂浮细胞数、抗凝、纤溶指标等变化。结果与对照组相比,模型组培养液中的漂浮细胞数显著增高,前列环素(6-keto-PGF1α)和NO
2、水平显著下降,组织型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)活性增高,组织型纤溶酶原激活物(t-PA)活性显著降低;蝎毒纤溶活性肽在较高剂量组能显著提高6-keto-PGF1α和NO水平、调节PAI-1和t-PA活性。结论实验制备的HUVECs缺氧损伤模型存在着内皮细胞(EC)受损,纤溶、抗凝功能失调;蝎毒纤溶活性肽对缺氧环境下受损EC具有保护作用。【关键词】蝎毒纤溶活性肽;缺氧;内皮细胞;前列环素;组织型纤溶酶原激活物在正常情况，EC的促栓促凝与抗栓抗凝处于动态平衡之中，血管内皮细胞分泌众多生物活性物质，它们相互协同，相互拮抗.freel产品),.freela产品),组织型纤溶酶原激活剂及
3、其抑制物-1(上海太阳生物试剂公司生产)，NO试剂盒(南京建成生物技术研究所)，6-Keto-PGF1α(北京东亚免疫技术研究所)。1.2仪器CO2培养箱(FormatScientificCo,美国),Multiskan酶标仪(Epson,日本),倒置相差显微镜(上海显微镜厂产品)，SN-682型放免γ-计数器(上海日环核仪厂)。2方法2.1原代内皮细胞的培养方法参照文献2方法,在无菌条件下取健康产妇正常分娩胎儿脐带25～30cm，用Hank's液将脐静脉中残血冲洗干净后,注入体积分数为0.1%的胶原酶消化,于消化下内皮细胞中加入完全培养液(含体积分数为20%胎牛血清,2mmol/L谷
4、氨酰胺,50IU/ml青霉素,50mg/L链霉素,50μg/L肝素,50μg/L内皮细胞生长因子及Hapes液的M199培养基),用吸管轻轻吹打,制成细胞悬液,细胞计数为2.0×105L-1,接种入25cm2平皿中,于CO2培养箱中37℃孵育，待细胞长成融合状态后作细胞鉴定。血管内皮细胞特征：相差显微镜下呈单层铺路石样排列，用免疫法测定第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。确定为内皮细胞后再传代培养，取第3代生长良好的人脐静脉内皮细胞进行实验。2.2内皮细胞缺氧损伤模型制备3，4人脐静脉内皮细胞生长至80%以上融合的单层细胞时，消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.0×105L-1，分别接种于2
5、4孔培养板。24孔板每孔加入200μl细胞悬液，次日换液，第3天进行造模。吸去板中培养液,用PBS冲洗3次,加入不含胎牛血清的培养液,置入自制的密闭缺氧罐中，持续通入混合气体(含95%N2、5%CO2)3L/min,置换容器中的氧气。待该容器内氧气分数低于1%后，停止通气，置37℃孵箱中培养12h，造成缺氧模型。全量收集该EC上清液,离心(10000g×3min)除去培养液中的细胞碎片,置-20℃冰箱备用。2.3实验分组与药物干预实验随机分为：①正常对照组：更换无小牛血清的培养液(2ml),置于37℃体积分数0.95O2+0.05CO2的培养箱中正常培养12h，按上述方法,收集培养液。
6、②缺氧模型组：制备缺氧模型，置于体积分数0.95的N2+0.05的CO2缺氧环境12h。③药物干预组：分为3个小组(分别称低、中、高剂量组)，更换含SVFAP培养液中培养,培养液中SVFAP终浓度分别为2，4，8mg/L，正常培养1h后放入含95%N2、5%CO2混合气体的培养缸内(缺氧环境),余同缺氧组处理，每组8孔。2.4指标检测及方法观察细胞形态及培养上清液中的漂浮细胞情况。取各组培养液,采用发色底物法测定组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI)活性;采用放免法测定前列环素稳定代谢产物6-keto-PGF1α;采用酶法测定NO水平。具体检测方法主要参照试剂盒说明书进行
7、。2.5统计学方法结果以±s表示,各组间差异比较用方差分析。3结果3.1各组细胞培养上清液中漂浮细胞和6-keto-PGF1α、NO水平的变化表1显示,模型组在缺氧12h后,漂浮细胞数显著高于对照组,表明缺氧后EC受损。与模型组相比,SVFAP组可显著降低漂浮细胞数,表明其对细胞在缺氧环境下的生长具有保护作用。模型组在缺氧12h时,6-keto-PGF1α和NO的量显著低于正常组,表明模型组缺氧后EC受损,分泌抗凝因子功能降低。与模型组相比,S
