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1、蝎毒纤溶活性肽预处理对缺氧血管内皮细胞抗凝和纤溶【摘要】目的应用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧模型,探讨蝎毒纤溶活性肽(SVFAP)对缺氧损伤内皮细胞的保护作用。方法对培养的HUVECs传代并分组：对照组常规培养;缺氧组将其放入含95%N2、5%CO2混合气体的缺氧环境中培养12h,制备HUVECs缺氧损伤模型;药物干预组分别将终浓度为2，4，8mg/L的SVFAP加入细胞培养液中进行培养，1h后进行缺氧模型复制。观察各组细胞培养上清液中漂浮细胞数、抗凝、纤溶指标等变化。结果与对照组相比,模型组培养液中的漂浮细胞数显著增
2、高,前列环素(6-keto-PGF1α)和NO水平显著下降,组织型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)活性增高,组织型纤溶酶原激活物(t-PA)活性显著降低;蝎毒纤溶活性肽在较高剂量组能显著提高6-keto-PGF1α和NO水平、调节PAI-1和t-PA活性。结论实验制备的HUVECs缺氧损伤模型存在着内皮细胞(EC)受损,纤溶、抗凝功能失调;蝎毒纤溶活性肽对缺氧环境下受损EC具有保护作用。【关键词】蝎毒纤溶活性肽;缺氧;内皮细胞;前列环素;组织型纤溶酶原激活物 在正常情况，EC的促栓促凝与抗栓抗凝处于动态平衡之中，血管内皮细胞
3、分泌众多生物活性物质，它们相互协同，相互拮抗，参与调节血管张力，抗血栓形成，止血，纤溶，维持正常的血液循环。在病理条件下(如缺血缺氧)，血管内皮细胞受损，致使EDRF、PGI2、t-PA等抗凝纤溶物质的生成/释放减少，促使血管痉挛，血栓形成。 全蝎作为我国传统名贵药材,具有祛风、止痉、通络、解毒之功效。蝎毒作为其发挥作用的主要成分,能够保护血管内皮细胞而发挥抗凝、纤溶等作用[1]。但其对于缺氧性损伤的血管内皮细胞是否具有同样的保护作用，尚未见报道。笔者在前期研究工作的基础上，以缺氧损伤人脐静脉内皮细胞为受试对象,进一步探讨其
4、纤溶主要成分——蝎毒纤溶活性肽对缺氧损伤内皮细胞的保护作用，以期为拓展其临床应用打下理论基础。 1材料与仪器 1.1药物与试剂SVFAP(潍坊医学院应用药理研究室提供),M199培养基(GIBCO产品),内皮细胞生长因子(BoehringerMannheim产品),胶原酶(Sigma产品),组织型纤溶酶原激活剂及其抑制物-1(上海太阳生物试剂公司生产)，NO试剂盒(南京建成生物技术研究所)，6-Keto-PGF1α(北京东亚免疫技术研究所)。 1.2仪器CO2培养箱(FormatScientificCo,美国),Mult
5、iskan酶标仪(Epson,日本),倒置相差显微镜(上海显微镜厂产品)，SN-682型放免γ-计数器(上海日环核仪厂)。 2方法 2.1原代内皮细胞的培养方法 参照文献[2]方法,在无菌条件下取健康产妇正常分娩胎儿脐带25～30cm，用Hank's液将脐静脉中残血冲洗干净后,注入体积分数为0.1%的胶原酶消化,于消化下内皮细胞中加入完全培养液(含体积分数为20%胎牛血清,2mmol/L谷氨酰胺,50IU/ml青霉素,50mg/L链霉素,50μg/L肝素,50μg/L内皮细胞生长因子及Hapes液的M199培养基),用吸
6、管轻轻吹打,制成细胞悬液,细胞计数为2.0×105L-1,接种入25cm2平皿中,于CO2培养箱中37℃孵育，待细胞长成融合状态后作细胞鉴定。血管内皮细胞特征：相差显微镜下呈单层铺路石样排列，用免疫法测定第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。确定为内皮细胞后再传代培养，取第3代生长良好的人脐静脉内皮细胞进行实验。 2.2内皮细胞缺氧损伤模型制备[3，4]人脐静脉内皮细胞生长至80%以上融合的单层细胞时，消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.0×105L-1，分别接种于24孔培养板。24孔板每孔加入200μl细胞悬液，次日换液，第3天进
7、行造模。吸去板中培养液,用PBS冲洗3次,加入不含胎牛血清的培养液,置入自制的密闭缺氧罐中，持续通入混合气体(含95%N2、5%CO2)3L/min,置换容器中的氧气。待该容器内氧气分数低于1%后，停止通气，置37℃孵箱中培养12h，造成缺氧模型。全量收集该EC上清液,离心(10000g×3min)除去培养液中的细胞碎片,置-20℃冰箱备用。 2.3实验分组与药物干预实验随机分为：①正常对照组：更换无小牛血清的培养液(2ml),置于37℃体积分数0.95O2+0.05CO2的培养箱中正常培养12h，按上述方法,收集培养液。②
8、缺氧模型组：制备缺氧模型，置于体积分数0.95的N2+0.05的CO2缺氧环境12h。③药物干预组：分为3个小组(分别称低、中、高剂量组)，更换含SVFAP培养液中培养,培养液中SVFAP终浓度分别为2，4，8mg/L，正常培养1h后放入含95%N2、5%CO2混合气体的培养
