青藤碱对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤后bcl2和caspase3表达的影响

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1、青藤碱对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤后Bcl2和caspase3表达的影响作者：吴岚周素娴刘开祥俸军林李清华、【摘要】　　目的探讨青藤碱(Sin)对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤后Bcl2及caspase3蛋白表达的影响。方法采用高脂高糖饮食加腹腔注射小剂量链佐菌霉素建立糖尿病大鼠模型，造模成功后将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Sin低剂量治疗组和Sin高剂量治疗组。线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。Sin低（30mg/kg）、高剂量（60mg/kg）治疗组于术前30min分别给予大鼠腹腔注射。用免疫组化法观察缺血90

2、min再灌注24h大鼠额顶部皮质Bcl2和caspase3蛋白表达，并进行TTC染色和HE染色观察脑梗死体积及病理形态学变化。结果①糖尿病大鼠脑缺血再灌注24h，缺血再灌注组Bcl2和caspase3表达与假手术组比较增加（均P<0.05）；与缺血再灌注组比较，Sin高、低剂量治疗组Bcl2表达均显著增加，caspase3表达减少，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。②Sin治疗组脑梗死体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。③Sin高、低剂量治疗组

3、脑组织缺血损伤病理学改变明显轻于缺血再灌注组，Sin高剂量治疗组缺血改变亦轻于低剂量治疗组。结论Sin对糖尿病大鼠缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与增加Bcl2蛋白表达同时降低caspase3蛋白表达有关。【关键词】缺血再灌注；Bcl2；caspase3；青藤碱　　在糖尿病高血糖情况下，缺血性脑损伤加重可能与乳酸堆积、兴奋性氨基酸、自由基、Ca2+超负荷及细胞凋亡等有密切关系。青藤碱(Sin)是从中药青风藤中提取的生物碱单体。它具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用。前期研究证实，青藤碱对正常血糖

4、大鼠缺血再灌注脑损伤有保护作用〔1〕，但机制未明。本实验通过建立糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究Sin对其Bcl2和caspase3蛋白表达的影响，探讨其保护作用的可能分子生物学机制。　　1材料与方法　　1.1糖尿病大鼠模型建立及实验动物分组　　健康a公司)，继续高糖高脂饲料喂养,于注射后1、2个月测定体重和血糖〔3〕。选择非空腹血糖16.7～25.6mmol/L的大鼠作为造模成功的糖尿病大鼠。经检测模型成功大鼠共45只，将其中40只大鼠按随机分组原则分为假手术组（10只）、缺血再灌注组（10只）、Sin低剂量治疗组

5、（10只）及Sin高剂量治疗组（10只）。　　1.2方法　　1.2.1给药方法　　Sin低剂量治疗组（30mg/kg）和高剂量治疗组（60mg/kg）均于术前30min分别给予大鼠腹腔注射，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水腹腔注射。缺血再灌注组和Sin低、高剂量治疗组建立脑缺血90min再灌注24h动物模型。　　1.2.2脑缺血再灌注损伤模型的建立　　参照Longa等〔4〕方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。神经功能缺陷评分：各组分别在再灌注24h进行评分。0分：正常，无神经学征象；1分：动物不能完全伸展右前肢；2分：

6、动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象；3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚；4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在1～3分为模型成功。　　1.2.3Bcl2和caspase3表达的免疫组化染色　　再灌注24h，各组随机取5只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11mm之间冠状切取约5mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚5μm。连取5张，1张作HE染色，观察病理形态学改变。其余4张作免疫组化染色。用SP法进行Bcl2和cas

7、pase3蛋白的免疫组化染色。一抗由北京中山生物技术有限公司提供。阴性对照片用PBS液代替一抗。在细胞质内出现棕黄染色颗粒代表Bcl2和caspase3蛋白阳性表达细胞。于每个鼠脑取1张切片，每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复高倍镜视野（×400），计数每个视野阳性细胞数，算出平均数即为每张切片阳性细胞数。　　1.2.4TTC染色　　再灌注24h，将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于-4℃冰箱20min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2％TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析

8、仪及梯形法计算出梗死灶体积，各脑片梗死灶体积之和即为梗死体积。左侧大脑半球梗死灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部分组织表现为由白色向红色过渡区。　　1.3统计学方法　　数据处理采用SPSS11.5统计软件进行分析，结果以x±s表示,组间差异显著性检验采用