依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响

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1、依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响作者：于亚新刘宝华李海峰刘晓亮【摘要】目的观察脑神经保护剂依达拉奉对创伤性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用，并探讨其作用机制。方法采用大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型，通过凋亡原位TUNEL检测评价神经细胞凋亡情况，并采用免疫组化的方法检测各组不同时段大鼠脑组织caspase3的表达。结果脑缺血再灌注后凋亡细胞在48h达到高峰，治疗组和模型组比较在48、72h差异有统计学意义(P<0.05)。caspase3在缺血再灌注12h起显著增加，

2、48h达高峰期。治疗组与模型组比较，再灌注后48、72h可明显降低caspase3表达(P<0.05)。结论脑缺血后caspase3表达增高，自由基清除剂依达拉奉可以保护脑组织，其作用可能与抑制caspase3在损伤脑组织中的表达有关。【关键词】缺血再灌注损伤;caspase3;凋亡;依达拉奉8原发性脑损伤后继发的缺血再灌注损伤成为脑损伤不可逆的主要因素。目前依达拉奉(edaravone)是对脑缺血再灌注损伤中产生的自由基进行清除的有效药物，通过清除自由基及其引发的脂质过氧化抑制脑水肿和迟发性

3、神经细胞死亡，从而有效改善神经缺损体征〔1〕。依达拉奉从根本上改变了脑损伤急性期的治疗策略和神经保护治疗措施。本文拟探讨依达拉奉对缺血再灌注损伤后大鼠脑caspase3表达的影响。　　1材料与方法　　1.1动物选用健康雄性清洁级SD大鼠160只,体重200～280g,鼠龄3～4个月,由吉林大学基础医学院动物中心提供。　　1.2模型制备与分组将入选的动物随机分成正常组、假手术组、模型组和治疗组,其中正常组、假手术组各5只大鼠,假手术组给予麻醉及切口暴露。模型组和治疗组又分为缺血2h再灌注6、12、24、48

4、、72h组,每小组各5只大鼠。在22℃环境温度中实验，予3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，行颈正中切口，暴露双侧颈总动脉，麻醉减浅后，右侧上无创微动脉夹夹闭30min，制作大鼠右侧大脑缺血再灌注模型。选用苏醒后行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为模型成功者进行实验。　　1.3实验药物与给药方法实验药物依达拉奉(必存注射液)由南京先声药业有限公司提供。给药方法为再灌注同时予尾静脉注射给药,之后每隔12h注射给药1次,直至动物被处死。给药剂量为0.3mg/100g，浓度为1.5mg/ml。8　　1.4

5、取材及标本处理在预定的时间麻醉，开胸，灌注固定，断头取脑。在视交叉后1mm及4mm处冠状切面切开鼠脑，取中间切块以观察，进行脱水，石蜡包埋。切片分别进行HE染色，细胞凋亡检测，caspase3免疫组化染色。　　1.4.1HE染色切片常规脱蜡，水化苏木素染色5min盐酸乙醇分色30s，伊红复染1～2min，水洗、脱水、透明、中性树胶封片。　　1.4.2神经细胞凋亡原位TUNEL检测(1)石蜡包埋切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，l×TBS(20mmol/LTris，pH7.6;140mmol/LNaCl)洗

6、涤。(2)用10mmol/LTrisCl(pH8.0)稀释蛋白酶K(终浓度为20μg/ml)100μl，覆盖整个样本，室温孵育20min以灭活内源性过氧化物酶，l×TBS洗涤。(3)用甲醇1∶10稀释30%H2O2，每个样本用10μl30%H2O2与90μl甲醇混合液室温孵育5min，1×TBS洗涤。(4)加100μl用蒸馏水1∶10稀释的10×TdT平衡缓冲液(0.5mol/LTris，pH8.0;0.5mol/LNaCl;0.1mol/LMgCl2)，室温孵育20min，吸去液体，加60μldUTP标

7、记反应混合液(58.4μldUTP标记反应混合物;1.6μlTdT酶)，37℃孵育1.5h，l×TBS洗涤，加100μl终止液(0.5mol/LEDTA，pH8.0)，1×TBs冲洗，加100μl封闭液(4%BSA/PBS)，室温孵育10min，吸去液体。(5)加100μl链卵白素(streptavidin)标记的过氧化物酶溶液，室温孵育30min，1×TBS洗涤。(6)加100μlDAB显色液溶于1ml0.05mol/LTBS8pH7.6，室温孵育10min，蒸馏水漂洗，苏木素衬染。梯度酒精常规脱水，二甲

8、苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。(7)阴性对照片用PBS代替TdT酶，其余步骤相同。　　1.4.3caspase3蛋白检测(1)组织切片常规二甲苯脱腊、梯度酒精脱水。(2)蒸馏水新鲜配制3%H2O2，室温作用10min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。(3)微波修复抗原:将切片浸入0.1mol/L柠檬酸缓冲液(柠檬酸钠12.05g，柠檬酸1.891g，加蒸馏水500ml，pH6.0)中，微波炉加热至沸腾后