螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用

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1、螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用作者：李旭，孟莹，张振书，张小兰，黄茂梁【摘要】目的：探讨螺内酯对实验性肝纤维化的影响及其作用机制.方法:雄性SA检测NFκBDNA结合活性；ETHODS:Todelgroup,theratsrecEIvedinjectionof40%CCl42.5mL/kgsubcutaneously,threetimesaentgroup,theratsreceivedinjectionof40%CCl4asinistrationofspironolactone20mg/(

2、kg·d).Incontrolgroup,theratsreceivedinjectionofoliveoilonly.After4orphologicalexaminationed.TheexpressionofTGFβ1proteininlivertissueinedbySA）atrixmetalloproteinase2,9(MMP2,9)ography.Invitro,HSC（hepaticstellatecell）T6cellsol/L(aninhibitorofaldoste

3、rone)priortoexposuretoaldosterone(Aldo)1μmol/Lfor1h.DNAbindingactivityofNFκBinedbyMP2,9.StimulationofHSCbyAldopromotesNFκBbindingactivity;spironolactone;livercirrhosis;NFκB　　0引言　　肝脏肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）的激活与肝纤维化形成密切相关.肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化的中心环节，HSC可表达

4、醛固酮（Aldo）合成酶基因CYP11B2，Aldo拮抗剂螺内酯可以抑制实验性肝纤维化形成.此外，canrenone（Aldo拮抗剂螺内酯的活性代谢产物）可抑制人HSC的增殖和移动［1］.然而，目前螺内酯抗肝纤维化机制尚未明确.核因子κB(NFκB)负责调控与肝纤维化有关的基因，参与HSC的激活、转化和细胞外基质的合成，Aldo可增强HSCNFκBDNA结合活性［2］，而螺内酯对HSCNFκB活性的影响尚不明确，我们探讨螺内酯的抗肝纤维化机制及螺内酯对HSCNFκBDNA结合活性的作

5、用机制.　　1材料和方法　　1.1材料　　雄性SPF级otif公司）.αP32dATP(北京亚辉生物医学工程公司)；寡核苷酸探针（上海生工合成）.　　1.2方法　　1.2.1体内实验雄性L/LCCl4油（CCl4与橄榄油混合物）2.5mL/kgSC，3次/g/kg灌胃，1次/d.对照组：橄榄油SC.4in，取上清，Bradford法测定总蛋白浓度.取总蛋白100μg以120g/L,150g/LSADPAGE凝胶电泳分离.电转移蛋白至PVDF膜，50g/L脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗（TGFβ

6、1多抗，1∶700）于封闭袋中孵育2h，4℃；二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，1∶2000）孵育1h.化学发光法显示结果，压片曝光.凝胶图象分析系统（UVP公司）检测蛋白质印迹条带灰度.取新鲜肝组织100mg，加入1×Hypotonicbuffer(含DTT)3mL，匀浆，冰浴15min；4℃850r/min，10min；弃上清，加入1×Hypotonicbuffer重悬，冰浴15min；加入NP4025μL，震荡10s；4℃14000r/min，30s；收集上清即胞质蛋白，将沉淀重悬于

7、Lysisbuffer100μL中，震荡10s；置于摇床中冰浴30min，150次/min；再次震荡30s，4℃14000r/min，10min；取上清即为核蛋白，于-70℃保存，测定蛋白质浓度.NFκB寡核苷酸序列：5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′;5′AGTTGCCTGGGAAAGTCCCCTC3′.NFκB寡核苷酸探针经过聚合、稀释，使其终浓度为10pmol/L.加入NFκB寡核苷酸探针1μL，加10×Klenomol/L)3μL，三蒸水9μL，Klenoin.经

8、过柱纯化，测定比放射活性.取5μg核蛋白上样，采用80g/L聚丙烯酰胺凝胶，150V电泳2h.干胶后压片，-70℃冰箱中放射自显影，冲洗胶片.制备75g/L的分离胶及40g/L的浓缩胶，在分离胶中加入2g/L明胶，蛋白样品50μg中加入等量的2×蛋白质上样缓冲液(不含二硫苏糖醇).电泳结束后，将凝胶移入25mL/LTritonX100溶液中复性1h，再在孵育液（50mmol/LTrisClpH7.6,500mmol/LNaCl,5mmol/LCaCl2,0.2g/LNaN3）中37℃孵育24