雷公藤内酯醇体内外抗肿瘤作用

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1、雷公藤内酯醇体内外抗肿瘤作用作者：王恒邦,许建华,温彩霞黄秀旺,陈元仲【摘要】目的研究雷公藤内酯醇(TPL)的体内外抗肿瘤作用。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测TPL对多种肿瘤细胞生长的抑制作用;不同浓度TPL(25,50及100ng/mL)处理HL60细胞24h后,AnnexinVFITC/PI荧光染色法检测凋亡率,分光光度法检测细胞caspase3酶活化程度;建立S180、U14、B16小鼠移植肿瘤模型进行体内实验,观察TPL体内抗肿瘤活性。结果TPL对MCF7、HL60、MGC803、HepG2、U266、Ca46、Hela等多种人肿瘤细胞均有很强的生长抑制作用,

2、其IC50分别为34.37,5.51,31.95,6.31,9.74,26.96及9.75ng/mL;TPL实验组凋亡细胞百分率显著上升,caspase3酶活化程度明显升高;对S180、U14、B16等小鼠肿瘤均有明显抑制作用,抑制率分别达到61.0%,41.8%及58.0%。结论TPL体内体外均有较强抗肿瘤作用,其机制与激活caspase3诱导肿瘤细胞凋亡有关。【关键词】雷公藤内酯;抗肿瘤药,植物;细胞凋亡;肿瘤雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)由卫矛科植物雷公藤根(去皮)提取、精制而成,是其主要活性成分之一,具有抗炎、免疫抑制和抗生育等多种药理作用,广泛用于治疗自身免疫性疾

3、病、器官移植等。研究发现在体外实验中TPL具有很强的抗肿瘤活性[14]。笔者采用MTT法、荧光染色法、分光光度法及应用小鼠移植肿瘤模型对其体内外抗肿瘤作用及其机制作进一步研究。1材料与方法1.1材料1.1.1药品及试剂TPL由福建医科大学药学院天然药物系提供,样品经高效液相色谱分析纯度约99.9％,于实验前以丙二醇(1mg/mL)新鲜配制,使用时以培养液稀释至所需浓度(丙二醇终浓度≤0.01％），微孔滤膜(0.22μm)除菌。依托泊苷注射液(VP16,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:vp051202);丙二醇(国药集团化学试剂有限公司,批号:20041026);RPMI1640、胎牛血

4、清(美国Gibco公司);MTT(美国Sigma);AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,批号:060526);caspase3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,批号:060830)。1.1.2细胞株及动物MCF7、HL60、MGC803、HepG2、U266、Ca46、Hela等人肿瘤细胞由本研究所冻存提供。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中(含青霉素100U/mL,链霉素100mg/L),置37℃、体积分数为0.05的CO2的培养箱。普通级昆明小鼠[福建医科大学实验动物中心,合格证号:SCX(闽)200

5、4002],清洁级C57小鼠[上海斯莱克实验动物有限公司,合格证号scxk(沪)20030003],雌雄不拘,体质量(18±2)g。1.1.3仪器流式细胞仪(EPICSXL,美国Backman公司);紫外分光光度计(Cary50,美国Varian公司)。1.2方法1.2.1MTT法检测将对数生长期的肿瘤细胞以1.5×104mL1接种于96孔培养板中,每孔200μL,每组重复3孔。实验组加入不同浓度的TPL(2.5,5.0,10,20,50及100ng/mL),对照组加入等体积(含0.01％丙二醇)RPMI1640溶液(贴壁细胞预培养24h贴壁后加药)。TPL作用48h后加入MTT(

6、5mg/mL)继续培养4h,小心吸弃上清液,加入DMSO150μL振荡溶解完全,酶标仪检测D(570nm),根据下列公式计算抑制率并计算IC50:抑制率＝1-(实验组D值/对照组D值)×100%1.2.2流式细胞仪检测取对数生长期的HL60细胞以5×105mL1接种于6孔板,实验组分别加入25,50或100ng/mL的TPL,对照组加入等体积(含0.01％丙二醇)RPMI1640溶液,作用24h后收集细胞,按AnnexinVFITC/PI双染用流式细胞仪检测凋亡率,按试剂盒说明书操作。1.2.3TPL对caspase3酶活性的影响细胞处理同1.4.2,作用24h后收集细胞,按casp

7、ase3分光光度法检测试剂盒说明书操作,紫外分光光度计检测D值(405nm),计算活化程度:活化程度＝实验组D值/对照组D值1.2.4TPL的体内抗肿瘤作用参照图1TPL抑制肿瘤细胞的量效关系曲线Fig1DoseeffectrelationshipofTPLontheproliferationoftumorcells2.2凋亡率对照组HL60细胞凋亡率为7.02％(早期4.22%,晚期2.80%);不同