少棘蜈蚣活性蛋白提取及纤溶作用性质研究论文

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1、少棘蜈蚣活性蛋白提取及纤溶作用性质研究论文刘兵，谭竹钧，陈明军，刘浩，陈雅雄【摘要】目的研究少棘蜈蚣活性蛋白的纤溶性及其性质。方法通过硫酸铵分段盐析、DEAE纤维素柱和SephadexG-75柱层析从少棘蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch组织分离纯化出纤溶性活性蛋白，纤维蛋白平板法测定其纤溶性，SDS-PAGE测定样品纯度和分子量，温度、pH改变对少棘蜈蚣纤溶性蛋白活性的影响。结果分离纯化到一种相对分子质量约为48.3kD的纤溶性蛋白.freelg。结论少棘蜈蚣活性蛋白具有纤溶性，该成分在40℃下基本稳定，最适温度35℃，

2、最适pH8.0。【关键词】少棘蜈蚣活性蛋白分离提取纤溶活性Abstract：ObjectiveTostudythefibrinolyticactivityoftheactiveproteinofScolopendrasulspinipesmulticans.MethedAnoveloffibrinolyticproteinmoniumsuplhatesub-precipitation,DEAE-celluloseandSephadexG-75columnchromatographyfromthetissueoftheScolopendrasubspinipesmu

3、tilansL.Koch.ResultTheproteinshooleculardodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisanalysis.Itsspecificactivitytohydrolyzefibring.Theactivityofenzymeethanesulfonylfluoride(PMSF),butinotetraaceticacid(EDTA).CorclusionTheproteinisstableunder40℃,theoptimumtemperatureis35℃,andtheoptim

4、umpHis8.0.KeyutilansL.Koch;Activeprotein;Purification;Fibrinolyticactivity蜈蚣属陆生节肢动物，是我国传统的中药材之一。目前蜈蚣药材主流商品为少棘蜈蚣，产量约占95％，少棘蜈蚣Scolopendrasubspinipesmutitans全虫入药，已有二千多年的使用历史，有熄风解痉、消肿解毒的功能，主治小儿惊风、破伤风、抽搐、口眼歪斜、淋巴结结核、肿毒疮疡等。对其活性蛋白研究有利于进一步探索其药用作用机理，纤溶活性研究为进一步研究其溶栓和抗癌活性奠定基础。1材料与仪器1.1药材少棘蜈蚣Scolo

5、pendrasubspinipesmutilansL.Koch购自安徽滁州大丰养殖场，由谭竹钧教授对其进行种类鉴定，挑取活体于-80℃冰箱中冻存。1.2仪器自动柱层仪(包括梯度混合器、横流器、自动部分收集器、紫外检测仪、小型台式记录仪)，上海沪西分析仪器厂有限公司产品；pH计［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，其精度为±0.01pH］；高速冷冻离心机（KDC-160HR，科大创新股份有限公司中佳分公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；真空冷冻干燥器（LABCONCO，美国）；HHS电热恒温水浴锅（上海博泰实验设备有限公司

6、）；DYY－Ⅲ稳压稳流电泳仪和DYY－Ⅲ28垂直夹芯电泳槽（北京六一仪器厂）。1.3试剂Sephadexg-75，台州市路桥四甲生化塑料厂出品；DEAE-32，广东省汕头市西陇化工厂分装；十二烷基硫酸钠（SDS），天津市瑞金特化学品有限公司产品；丙烯酰胺，天津市大茂化学试剂厂产品；考马斯亮蓝R-250、G-250，北京鼎国生物技术有限责任公司产品；牛血清白蛋白（BSA），牛血纤维蛋白原sigma-F8630、凝血酶sigma-T4648，广州宽林仪器科技有限公司产品；尿激酶，中国药品生物制品检定所提供。2方法2.1少棘蜈蚣粗提物的制备［1］取-80℃冻死的新鲜蜈蚣

7、16条，4℃冰箱中解冻后称重46.72g，剪刀绞碎于研钵中研磨至糜状，按SF对蜈蚣纤溶活性蛋白活力影响的实验表明，不同浓度EDTA对少棘蜈蚣纤溶蛋白影响不大，表明纤溶蛋白不属于金属酶类；而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF则能完全抑制该蛋白的纤溶活性，表明少棘蜈蚣纤溶活性蛋白可能属于丝氨酸类蛋白酶类［7］。市售纤维蛋白原内常含有少量纤溶酶原，纤溶酶原可在纤溶激酶作用下变为纤溶酶，纤溶酶作用于纤维蛋白后出现纤溶圈，为了探究少棘蜈蚣纤溶活性蛋白的作用机理，将制备好的纤维蛋白平板置80℃处理30min，使其中纤维蛋白溶酶原全部失活，制成去纤溶酶纤维蛋白平板，以未加热纤维蛋白平板

8、做对照，对