少棘蜈蚣活性蛋白提取及纤溶作用性质研究

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1、少棘蜈蚣活性蛋白提取及纤溶作用性质研究刘兵，谭竹钧，陈明军，刘浩，陈雅雄【摘要】　　目的研究少棘蜈蚣活性蛋白的纤溶性及其性质。方法通过硫酸铵分段盐析、DEAE纤维素柱和SephadexG-75柱层析从少棘蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch组织分离纯化出纤溶性活性蛋白，纤维蛋白平板法测定其纤溶性，SDS-PAGE测定样品纯度和分子量，温度、pH改变对少棘蜈蚣纤溶性蛋白活性的影响。结果分离纯化到一种相对分子质量约为48.3kD的纤溶性蛋白，水解纤维蛋白的比活力为42.36u/mg。结论少棘蜈蚣活性蛋白具有纤溶性，该成分

2、在40℃下基本稳定，最适温度35℃，最适pH8.0。【关键词】少棘蜈蚣活性蛋白分离提取纤溶活性　　Abstract：ObjectiveTostudythefibrinolyticactivityoftheactiveproteinofScolopendrasulspinipesmulticans.MethedAnoveloffibrinolyticproteinmoniumsuplhatesub-precipitation,DEAE-celluloseandSephadexG-75columnchromatographyfromthetissueofthe

3、ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch.ResultTheproteinshooleculardodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisanalysis.Itsspecificactivitytohydrolyzefibring.Theactivityofenzymeethanesulfonylfluoride(PMSF),butinotetraaceticacid(EDTA).CorclusionTheproteinisstableunder40℃,theoptimum

4、temperatureis35℃,andtheoptimumpHis8.0.　　KeyutilansL.Koch;Activeprotein;Purification;Fibrinolyticactivity　　蜈蚣属陆生节肢动物，是我国传统的中药材之一。目前蜈蚣药材主流商品为少棘蜈蚣，产量约占95％，少棘蜈蚣Scolopendrasubspinipesmutitans全虫入药，已有二千多年的使用历史，有熄风解痉、消肿解毒的功能，主治小儿惊风、破伤风、抽搐、口眼歪斜、淋巴结结核、肿毒疮疡等。对其活性蛋白研究有利于进一步探索其药用作用机理，纤溶活性研究为进一

5、步研究其溶栓和抗癌活性奠定基础。　　1材料与仪器　　1.1药材　　少棘蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch购自安徽滁州大丰养殖场，由谭竹钧教授对其进行种类鉴定，挑取活体于-80℃冰箱中冻存。　　1.2仪器　　自动柱层仪(包括梯度混合器、横流器、自动部分收集器、紫外检测仪、小型台式记录仪)，上海沪西分析仪器厂有限公司产品；pH计〔梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，其精度为±0.01pH〕；高速冷冻离心机（KDC-160HR，科大创新股份有限公司中佳分公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限

6、责任公司）；真空冷冻干燥器（LABCONCO，美国）；HHS电热恒温水浴锅（上海博泰实验设备有限公司）；DYY－Ⅲ稳压稳流电泳仪和DYY－Ⅲ28垂直夹芯电泳槽（北京六一仪器厂）。　　1.3试剂　　Sephadexg-75，台州市路桥四甲生化塑料厂出品；DEAE-32，广东省汕头市西陇化工厂分装；十二烷基硫酸钠（SDS），天津市瑞金特化学品有限公司产品；丙烯酰胺，天津市大茂化学试剂厂产品；考马斯亮蓝R-250、G-250，北京鼎国生物技术有限责任公司产品；牛血清白蛋白（BSA），牛血纤维蛋白原sigma-F8630、凝血酶sigma-T4648，广州宽林仪器

7、科技有限公司产品；尿激酶，中国药品生物制品检定所提供。　　2方法　　2.1少棘蜈蚣粗提物的制备〔1〕　　取-80℃冻死的新鲜蜈蚣16条，4℃冰箱中解冻后称重46.72g，剪刀绞碎于研钵中研磨至糜状，按ol/L磷酸钠缓冲液(pH7.6)，4℃冰箱中浸提过夜。4000r/min，4℃离心15min，去沉淀，16层砂布过滤，上清液加固体硫酸铵分段盐析,取35%～70%饱和度盐析组分透析浓缩,得到少棘蜈蚣粗提物。　　2.2提取物的分离、纯化〔2〕　　将上述蜈蚣粗提取物用聚乙二醇浓缩后上DEAE-纤维素柱(2.5cm×45cm)（预先用0.02mol/LpH8.0的

8、Tris-HCl缓冲液平衡过夜），用含1mol/LNaCl的0.0