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1、Paxillin在大鼠胰腺不同发育阶段的表达论文郭静，滕丽萍，刘莉洁，程梅，蔺扬波，德伟【关键词】桩蛋白；胰岛形成；逆转录聚合酶链反应；基因芯片Expressionofpaxillinduringratpancreaticdevelopment【Abstract】AIM:Toinvestigatetheexpressionprofileofgenesrelatedtoisletformationandmaturationduringpancreasdevelopment.METHODS:Thegeneexpressionpatt
2、ernsinembryonicday12.5(E12.5),E15.5,E18.5,neentigrationandadhesion(77.8%)E18.5,etranscriptionalfactorsexpressionbegantodecreasefromE18.5.Paxillinandactopaxinbryonicperiodmaybeimportanttopancreasdevelopment.Paxillinmayplayanimportantroleinisletformation.【Keyation;reve
3、rsetranscriptasepolymerasechainreaction;genechip【摘要】目的：探讨与胰岛形成和功能完善相关的基因在大鼠胰腺发育不同阶段的表达趋势.方法：采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5d（E12.5），E15.5，E18.5.freelatrix,ECM)与细胞骨架联系纽带，调节细胞移动和播散［2］.目前pxn在胰腺发育中的表达及相关功能的研究少见报道.本研究我们应用基因芯片技术建立大鼠胰腺不同发育时期的基因表达谱，明确其参与细胞黏附聚集和迁移相关基因的表达趋势，并应用RTPCR验证pxn和ac
4、topaxin的表达，为研究pxn在胰岛形成的作用提供线索.1材料和方法1.1材料成年SD大鼠45只，雌30只，雄15只,平均体质量250g，由南京医科大学实验动物中心提供.于每日18:00，将雌雄以1∶2合笼，次日检测有阴栓者，定为受精0.5d（embryonicday0.5,E0.5），取E12.5,E15.5,E18.5胚胎大鼠胰腺以及新生（出生1d）和成年大鼠胰腺.PCR仪（德国，Eppendorf）；XTLVI解剖镜（江西凤凰光学仪器有限公司）；RNA转录标记试剂盒，大鼠表达谱芯片RAE230A，芯片杂交炉，扫描仪，数
5、据采集软件和微阵列分析软件（美国，Affymetrix）；Tripure试剂(美国,Roche)；RNA纯化试剂盒（德国,.freelg组织加1mLRNA抽提剂，充分匀浆.匀浆后室温放置5min，加入氯仿200μL，剧烈振荡15s，室温放置2~3min，4℃12000g离心15min.将上清液转入新离心管中，加等量异丙醇沉淀RNA，室温放置10min，4℃12000g离心10min.弃上清，加1mL750mL/L乙醇，振荡洗涤沉淀，4℃7500g离心5min.弃上清，晾干，将RNA溶于30~50μL焦碳酸二乙酯水，测定其浓度，1
6、0g/L琼脂糖凝胶电泳，收集经凝胶成像系统观察到28srRNA与18srRNA比值接近2∶1的RNA，保存于-70℃冰箱.利用RNA纯化试剂盒纯化总RNA.1．2．3寡核苷酸芯片分析mRNA表达分别以15μgE12.5,E15.5,E18.5，新生和成年大鼠胰腺总RNA为模板合成双链cDNA，采用RNA转录标记试剂盒体外转录生成生物素标记的cRNA；再经纯化和片段化处理后，取30μgcRNA与大鼠表达谱芯片RAE230A杂交；洗脱后，用链酶亲和素－藻红蛋白进行染色扫描检测信号；对获得的信号在微阵列分析软件上进行数据分析并对样品的
7、表达结果采用线性度量的方法在样品间进行校准.E12.5及成年大鼠胰腺寡核苷酸芯片重复2次.1．2．4RTPCR取1μgE12.5,E15.5,E18.5，新生和成年大鼠5个时期胰腺组织总RNA进行反转录:30℃10min,42℃20min,99℃5min,4℃5min,合成cDNA.PCR扩增：pxn上游引物：5′GGAGCAGAACGACAAGCC3′,下游引物：5′GCACAGAGCCCAGGAGA3′,预计扩增产物256bp.actopaxin上游引物：5′GGAGGAGAATGAGGTGCG3′,下游引物：5′GCCGA
8、GGTTTAGGCTTTT3′,预计扩增产物812bp.18srRNA上游引物：5′ACGAACCAGAGCGAAAGC3′，下游引物：5′GGACATCTAAGGGCATCACAG3′,预计扩增产物514bp.actopaxin和18srRNA的PCR条件:9
