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1、Paxillin在大鼠胰腺不同发育阶段的表达郭静，滕丽萍，刘莉洁，程梅，蔺扬波，德伟【关键词】桩蛋白；胰岛形成；逆转录聚合酶链反应；基因芯片 Expressionofpaxillinduringratpancreaticdevelopment 【Abstract】AIM:Toinvestigatetheexpressionprofileofgenesrelatedtoisletformationandmaturationduringpancreasdevelopment.METHODS:Thegeneexpressionpatternsinembryonic
2、day12.5(E12.5),E15.5,E18.5,neentigrationandadhesion(77.8%)E18.5,etranscriptionalfactorsexpressionbegantodecreasefromE18.5.Paxillinandactopaxinbryonicperiodmaybeimportanttopancreasdevelopment.Paxillinmayplayanimportantroleinisletformation. 【Keyation;reversetranscriptasepolymerasechai
3、nreaction;genechip 【摘要】目的：探讨与胰岛形成和功能完善相关的基因在大鼠胰腺发育不同阶段的表达趋势.方法：采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5d（E12.5），E15.5，E18.5，新生和成年大鼠胰腺进行基因转录水平分析，并用RTPCR验证桩蛋白（pxn）和actopaxin在不同发育时期的表达情况.结果：与细胞迁移、聚集黏附相关的基因77.8%在胚胎18.5d高表达，22.2%在新生期高表达；整合素和激酶（ILK）在胚胎18.5d表达量最高，pxn和actopaxin在胚胎15.5d表达量达到高峰；成熟胰腺特异性基因多从胚胎18.5d开始
4、出现明显高表达，调节胰腺细胞分化的相关转录因子表达量多从胚胎18.5d开始下降.结论：Pxn在胚胎发育中后期的高表达可能与胰岛形成及功能完善有关. 【关键词】桩蛋白；胰岛形成；逆转录聚合酶链反应；基因芯片 0引言 胰腺的发育由复杂的基因网络调控，2004年Gu等〔1〕以基因芯片技术建立了胰岛分化相关转录因子的表达调控网络，然而胚胎发育后期胰岛细胞迁移聚集形成胰岛的相关机制尚未阐明.桩蛋白(paxillin,pxn)是一种细胞骨架上的磷酸蛋白，Mr为68×103，构成胞外基质(extracellularmatrix,ECM)与细胞骨架联系纽带，调节细胞移
5、动和播散〔2〕.目前pxn在胰腺发育中的表达及相关功能的研究少见报道.本研究我们应用基因芯片技术建立大鼠胰腺不同发育时期的基因表达谱，明确其参与细胞黏附聚集和迁移相关基因的表达趋势，并应用RTPCR验证pxn和actopaxin的表达，为研究pxn在胰岛形成的作用提供线索. 1材料和方法 1.1材料成年SD大鼠45只，雌30只，雄15只,平均体质量250g，由南京医科大学实验动物中心提供.于每日18:00，将雌雄以1∶2合笼，次日检测有阴栓者，定为受精0.5d（embryonicday0.5,E0.5），取E12.5,E15.5,E18.5胚胎大鼠胰腺以及新
6、生（出生1d）和成年大鼠胰腺.PCR仪（德国，Eppendorf）；XTLVI解剖镜（江西凤凰光学仪器有限公司）；RNA转录标记试剂盒，大鼠表达谱芯片RAE230A，芯片杂交炉，扫描仪，数据采集软件和微阵列分析软件（美国，Affymetrix）；Tripure试剂(美国,Roche)；RNA纯化试剂盒（德国,Qiagen）；RNAPCR试剂盒（日本，Takara）.引物由北京赛百盛基因有限公司合成. 1.2方法 1．2．1胰腺组织分离将E12.5,E15.5,E18.5母鼠引颈处死,分离出胚胎,解剖镜下用显微镊子取出胰腺,直接分离新生和成年大鼠胰腺,迅速在液
7、氮中冷冻. 1．2．2RNA提取每50~100mg组织加1mLRNA抽提剂，充分匀浆.匀浆后室温放置5min，加入氯仿200μL，剧烈振荡15s，室温放置2~3min，4℃12000g离心15min.将上清液转入新离心管中，加等量异丙醇沉淀RNA，室温放置10min，4℃12000g离心10min.弃上清，加1mL750mL/L乙醇，振荡洗涤沉淀，4℃7500g离心5min.弃上清，晾干，将RNA溶于30~50μL焦碳酸二乙酯水，测定其浓度，10g/L琼脂糖凝胶电泳，收集经凝胶成像系统观察到28srRNA与18srRNA比值接近2∶1的RNA，保存于-70℃冰
8、箱.利用RNA纯化试剂盒
