cerbb2反义寡核苷酸对人卵巢癌skov3细胞增殖的抑制作用论文

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1、cerbB2反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用论文吴永忠,任庆兰,李少林【摘要】目的探讨cerbB2基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法实验分空白对照组、正常对照组、cerbB2正义对照组及cerbB2反义治疗组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。结果反义治疗组与正义对照组比较：转染72hOD值分别为0.201与1.298（P＜0.01）；克隆形成率分别为26.5%与76

2、.5%（P＜0.05）；凋亡率分别为21.3%与7.5%（P＜0.05），同时明显地下调cerbB2蛋白质的表达水平（P＜0.05）。结论在卵巢癌的基因治疗中，cerbB2反义寡核苷酸能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖。【关键词】SKOV3细胞反义寡核苷酸卵巢癌cerbB2基因InhibitoryEffectsofcerbB2AntisenseOligodeoxynucleotidesTransfectionontheHumanOvarianCarcinomaSKOV3CellLines.Keya;cerbB2gene卵巢癌已成为女性

3、生殖系统恶性肿瘤死亡的首位原因。美国每年新发病率达到23000例左右［1］。其总的5年生存率不到30%2。近30年来，卵巢癌发病率上升了3倍，治疗手段虽有改进，疗效却仍然不令人满意。有作者指出生物治疗在卵巢癌的治疗中将起关键性的作用3，在分子水平上控制卵巢癌的发生发展可能成为最大的希望。本课题采用cerbB2反义寡核苷酸联合转染的方法.freela公司。cerbB2正义脱氧寡核苷酸（SODN）序列为：5′GGTTCACACGTGGCC3′，cerbB2ASODN序列为5′CCAAGTGTGCACCGG3′4。所有SODN与ASODN均由上

4、海生物工业公司合成并全部经硫代磷酸化修饰。RPMI1640培养基、小牛血清、各种抗体等试剂均购自美国hyclone公司。转染液为自制的无血清无抗生素RPMI1640培养液。实验所用仪器均由重庆医科大学分子生物学实验室提供。1.2方法1.2.1细胞培养SKOV3细胞在37℃、5%CO2条件下、含10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。传代培养时，将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化2～5min后，用RPMI1640培养液终止消化，在低速离心机上1500r/min离心5min，弃上清，再用PBS液重悬细胞，再离心5min。利用ELX800微孔

5、板读数仪调整细胞浓度后，接种到新的培养瓶。1.2.2实验分组共设立4组：0组:空白对照组，仅予以转染液处理;I组:正常对照组，阳离子脂质体lipofectin+转染液;Ⅱ组:正义治疗组，cerbB2SODN+lipofectin+转染液;Ⅲ组:反义治疗组，cerbB2ASODN+lipofectin+转染液。1.2.3脂质体转染方法按照产品说明书进行，脂质体与寡核苷酸的比例为1∶4。1.2.4MTT试验脂质体转染20h后再分别培养24、48、72h。培养48h时换液一次。到相应终止时间，弃原培养液，每孔加入转染液90μl，再加入MTT（5mg/ml）

6、10μl，放入CO2孵箱中孵育4h。弃上清，每孔加入DMSO100μl，震荡10min。酶联免疫检测仪570nm波长比色。1.2.5平板集落形成试验脂质体转染20h后，吸去上清液，用0.25%胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为103/ml。取9cm培养皿24个，每组3个平行皿，分别预置10ml普通培养液，做好分组标志。每皿接种单细胞悬液各200μl，即细胞数为200个/皿，然后十字方向轻巧晃动培养皿，使细胞分散均匀。将培养皿移入CO2孵箱中，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，静止培养2.5周。肉眼下计数细胞形成的集落数，对难以判断者，在显微镜下计

7、数＞50个细胞的集落数。集落形成率（%）＝计数细胞集落数/200×100%。1.2.6AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡脂质体转染20h后，弃上清，加入RPMI1640培养液再培养72h。培养48h时换培养液一次。新鲜配制AO/EB混合液，AO(100μg/ml)与EB(100μg/ml)按1∶1混合即可。培养72h终止实验，用无菌小镊子取出盖玻片，置于载玻片上，加AO/EB混合液一滴于盖玻片上，荧光显微镜下计数。凋亡率（%）=(VA＋NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。1.2.7流式细胞仪检测cerbB2蛋白（p185）脂质体转染20h

8、后，弃上清，加入RPMI1640培养液再培养72h