三氧化二砷对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖抑制的影响

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1、三氧化二砷对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖抑制的影响【摘要】目的观察As2O3对人卵巢癌细胞株SKOV3体外生长的影响。方法采用MTT比色法，测定不同浓度As2O3对SKOV3细胞生长的抑制作用，并绘制浓度抑制率量效曲线；用倒置显微镜及透射电镜观察药物作用后SKOV3细胞形态变化；流式细胞仪检测细胞周期变化。结果As2O3对SKOV3有明显抑制作用，且具有浓度和时间依赖性。72h时As2O3的IC50为4.67μM。As2O31.0～4.0μM作用于SKOV3细胞在24～72h后均出现G2/M期

2、阻滞，以48h最明显。As2O32.0μM作用24h、48h后流式细胞仪检测SKOV3细胞的凋亡率分别为3.68%、6.66%。倒置显微镜和透射电镜均观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征。结论As2O3对卵巢癌SKOV3细胞的生长有明显的抑制作用，并可诱导SKOV3细胞周期阻滞及细胞凋亡。【关键词】三氧化二砷卵巢肿瘤SKOV3三氧化二砷（As2O3），又称砒霜、亚砷酐等，是一个古老的药物，其应用历史悠久。1992年，孙洪德等[1]首先报道，运用癌灵1号（1%As2O3与痕量的Hg2Cl2合剂）治疗急

3、性早幼粒细胞白血病（APL）可达到较高的完全缓解率，从此一直被认为有剧毒的砷化物又重新引起了国内外肿瘤研究者们的关注。尽管砷剂在血液系统肿瘤中有了较深入的研究，但As2O3对实体瘤尤其是卵巢癌的作用目前研究尚少。因此，本文采用不同浓度的As2O3作用于卵巢癌SKOV3细胞株，初步探讨其对卵巢癌细胞生长抑制、周期阻滞及凋亡诱导的作用，为明确As2O3能否用于卵巢癌的治疗奠定基础。1材料和方法1.1细胞系人浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3（由重庆医科大学肿瘤病理生理学教研室提供），用RPMI1640（

4、含10%小牛血清）培养基于37℃、5%CO2条件下培养。实验用细胞均处于对数生长期。1.2化学试剂四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma）；0.1%亚砷酸注射液（哈尔滨伊达药业产品），用生理盐水配成1mmol/L贮存液，-20℃保存待用。临用前用RPMI1640（Hyclone）完全培养液稀释至工作浓度。1.3方法1.3.1药物浓度设置As2O3的血浆峰浓度（PPC）为1.5μM，依照PPC值设置As2O3工作浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μM。1.3.2MTT测定生长抑制率

5、将SKOV3细胞以1×104/孔加入96孔培养板，在37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，实验孔加入工作浓度的As2O3，反应体系200μl，每一浓度设5个复孔。并设细胞对照组及培养液对照组。分别培养24、48、72h，每孔加入MTT（5mg/ml，PBS临时配制）20μl，再培养4h，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200μl，振荡混匀，10min后在酶标仪590nm处读取每孔的吸光度A值，取平均值。计算细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组

6、A值）×100%。并以浓度抑制率曲线求出回归方程，得出中效浓度（IC50）。上述实验重复3次。1.3.3倒置显微镜及透射电子显微镜下细胞形态的观察倒置显微镜下观察培养板内加药组和未加药组不同时间细胞形态变化情况。收集36h对照组及2μMAs2O3处理组的细胞，0.01MPBS（pH7.4）洗2次，转入Eppendof管，加4%戊二醛1ml，固定60min，然后用1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，超薄切片，经醋酸铀、枸橼酸铅双重电子染色后Hitachi600透射电镜

7、观察和照相。1.3.4流式细胞仪检测凋亡率及细胞周期收集经1μM、2μM及4μMAs2O3及相应细胞对照组分别处理24h、48h、72h后的全部细胞，冰PBS洗2次，转入Eppendof管，加70%冷乙醇1ml固定，4℃过夜，次日离心弃上清，PBS洗2遍，重悬细胞于PBS中，加入RNase及PI，避光4℃染色30min，上机检测，激发波长488nm，并用ModFit软件分析。1.4统计方法所有计量数据均以均数±标准差（±s）表示，利用SPSS10.0统计软件，检验浓度抑制率曲线，

8、采用Logistic曲线回归法，进行F检验，组间分析用单因素方差分析（ONEWAYANOVA）。P<0.05表示差异有显著性。P<0.01表示差异有极显著性。2结果2.1As2O3对SKOV3细胞增殖的影响MTT法检测As2O3对SKOV3细胞作用不同时间的生长抑制效应见表1、图1（量效曲线），从图表可以看出，As2O3对SKOV3细胞有明显的生长抑制效应，其抑制作用具有浓度和时间依赖性，其抑制率随着药物浓度升高和作用时间延长而提高，差异均有极显著性（P<0.01）。