三氧化二砷对肝癌细胞株的体外抑制作用论文

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1、三氧化二砷对肝癌细胞株的体外抑制作用论文钟灿灿沈雁刘建伟陈志棠唐毅【关键词】肝癌细胞摘要:目的研究三氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞株HepG2，BEL7402的抑制作用。方法用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测用As2O3对肝癌细胞株HepG2，BEL7402生长及抑制率的影响；凋亡电泳检测电泳条带，流式细胞仪（FCM）分析细胞周期和凋亡率变化。结果在0.1~50.0μmol/L的浓度范围内As2O3对BEL7402、HepG2细胞的生长均有明显的抑制作用，且有时间和浓度的依赖性；凋亡电泳显示5μmol/LAs2O3对肝

2、癌细胞株HepG2，BEL7402凋亡率分别是46.7%和53.1%；流式细胞仪DNA组方图上可见细胞G1前期出现亚二倍峰。结论As2O3可抑制肝癌细胞株HepG2，BEL7402的生长，且在一定的范围内.freelol/L，而在体外抑制人肝癌细胞株HepG2的有效浓度有可能5μmol/L［3］，本研究旨在观察As2O3对人肝癌细胞株HepG2和BEL7402生长的影响，以探讨As2O3对原发性肝癌的作用及其机制，为寻找有效的肝癌化疗药物提供实验依据。1材料与方法1.1材料与仪器肝细胞株HepG2、BEL7402由中山

3、大学细胞库提供，As2O3、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季清公司，二甲基亚砜（DMSO，进口分装）。二氧化碳培养箱(SHELLAB，美国)，酶标仪(Reder，日本)。1.2分组本实验分为HepG2和BEL7402组：分别加入As2O3，终浓度为0(对照组)、0.1、0.5、1、5、10和50μmol/L，以RPMI1640培养液稀释，观察不同浓度对肝癌细胞株的影响。1.3方法1.3.1细胞培养在37℃、5%CO2培养箱，用含10%小牛血清及青

4、霉素、链霉素各1×105U的RPMI1640培养基培养，每2天换一次液，收集对数生长期的细胞进行实验。1.3.2MTT法观察As2O3对肝癌细胞株生长的影响。取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液调整细胞为6×104/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL细胞悬液，培养24h待细胞贴壁后按实验分组加入不同浓度药物，每孔100μL药物，对照组加入100μL培养液，每组浓度4个重复孔，放入37℃、5%CO2培养箱培养72h后，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，再培养4h，弃上清液，每孔加入DMSO200μL振荡

5、溶解10min，待甲瓒完全溶解后进行比色，在酶标仪以570nm主波长/690nm参比波长检测吸光度A值，并计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率，细胞生长抑制率：细胞生长抑制率＝［(1-实验组平均A值）/对照组平均A值］×100%。1.3.3DNA抽提及电泳经药物处理96h的细胞分别加裂解液和蛋白酶K，55℃水浴20min、加RNA酶10μL作用2min，酚、氯仿异戊醇各抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，取已抽提好的DNA5μL，在1.5%琼脂糖凝胶，5V/cm条件下，电泳3h，以λDANMarkerⅦ为分子标志，302nm紫外光

6、透照，观察电泳条带。1.3.4流式细胞仪分析5.0μmol/LAs2O3作用于肝癌细胞株HepG2和BEL7402处理4d后，离心收集细胞，应用PBS液洗涤2次，加入70%乙醇固定，离心去除上清液，加入200μLRNA酶在37℃处理1h，然后加800μLPI染色液放置4℃冰箱内30min以上，应用流式细胞仪检测细胞周期分析。1.3.5统计学方法用SPSS11.0进行方差齐性检验及单因素方差分析。以P0.05为有显著性。2结果2.1不同浓度As2O3对BEL7402、HepG2细胞生长的抑制作用As2O3在浓度1.0~5

7、0μmol/LAs2O3，抑制肝癌细胞株BEL7402，HepG2呈剂量的依赖性，浓度越高，细胞生长越低。结果显示：在0.1~5.0μmol/L的浓度范围内As2O3对BEL7402、HepG2细胞的生长均有明显的抑制作用。且有时间和浓度的依赖性，浓度越大，时间越长，对细胞生长的抑制作用越大。As2O3对BEL7402细胞株的生长抑制作用大于HepG2，见图1。2.2DNA电泳的检测5.0μmol/LAs2O3作用于HepG2和BEL7402细胞4d后，细胞DNA电泳上出现明显的DNA梯状降解条带，而经1.0μmol/

8、LAs2O3作用后的细胞Ladder带不明显，见图2。As2O3作用于BEL7402细胞有同样结果。三氧化二砷对肝癌细胞株的体外抑制作用图1不同浓度As2O3对BEL7402，HepG2细胞生长的抑制率2.4流式细胞仪检测（FCM）5.0μmol/LAs2O3作用于肝癌细胞株HepG2和BEL7402处理4d后，在流式细胞仪DNA