miz1基因sirna表达载体的构建及影响hela细胞对阿霉素的敏感性论文

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1、miz1基因siRNA表达载体的构建及影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性论文刘学武,沈岚,张健,刘新平【摘要】目的：构建针对转录因子miz1基因的siRNA表达载体，观察其影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性.方法：设计并合成针对miz1基因的siRNA寡核苷酸，克隆入siRNA表达载体,脂质体瞬时转染入HeLa细胞中,用RTPCR检测miz1基因的mRNA表达水平,用iz1蛋白表达水平，用MTT法检测HeLa细胞活力.结果：DNA测序和酶切鉴定证明针对miz1基因的siRNA表达载体构建成功，RTPCR和iz1；RNA干涉；转染；阿霉素0引言化疗是肿瘤治

2、疗的常规手段，拓扑异构酶Ⅱ抑制剂阿霉素作为常用的化疗药物之一，其能引起DNA断裂，诱导细胞凋亡，并且这一作用与靶细胞内某些基因如cmyc的表达水平密切相关.Miz1为Myc相互作用的锌指蛋白，属于POZZF转录因子家族成员［1］.目前发现Miz1能调节细胞的增殖和分化［2］，并与细胞凋亡密切相关［3］.在辐射引起细胞DNA损伤时，Miz1的敲弱可使细胞从G1期阻滞走向凋亡［4］，当阿霉素引起DNA损伤并诱导细胞凋亡时，Miz1的表达异常可能会影响阿霉素对靶细胞的杀伤效果.为探讨Miz1的表达与肿瘤细胞对阿霉素敏感性的关系，我们采用RNAi技术，构建了

3、针对Miz1的siRNA的表达载体转染入人宫颈癌细胞系HeLa,通过半定量RTPCR以及免疫印迹检测内源性Miz1的表达并采用MTT法检测HeLa细胞的活力，为进一步研究Miz1影响肿瘤细胞对阿霉素的敏感性机制提供依据.1材料和方法1.1材料pSilencerTM3.1H1neo载体（美国Ambion公司）；RNA反转录试剂(美国Promega公司)；各种限制性内切酶，T4DNA连接酶和PCR试剂（美国Gibco公司）；DNA提取及回收试剂盒（上海华舜公司）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；Odyssey红外荧

4、光扫描成像系统（美国LICOR公司）；大肠杆菌DH5α菌种，人宫颈癌细胞系HeLa（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存）；寡核苷酸片段（上海基康生物技术有限公司合成）；抗Miz1抗体（美国SantaCruz公司）；IRDyeTM800红外荧光标记的羊抗兔二抗（美国Rockland公司）.1.2方法1.2.1pSilencerTM3.1H1neomiz1基因载体的构建针对转录因子miz1基因的编码区选取19个核苷酸作为siRNA作用靶点,设计并合成两条寡核苷酸片段，5′GATCCCGCCTTACCTGTGTGATAAGTTCAAGAGACT

5、TATCACACAGGTAAGGCTTTTTTGGAAA3′及5′AGCTTTTCCAAAAAAGCCTTACCTGTGTGATAAGTCTCTTGAACTTATCACACAGGTAAGGCGG3′，其中GATCC为BamHⅠ酶切位点，AGCTT为HindⅢ酶切位点,GCCTTACCTGTGTGATAAG为设计的siRNA序列，TTCAAGAGA转录后形成发夹环.将上述两条寡核苷酸片段分别溶于双蒸水中至终浓度为50pmol/L.30μL退火体系中加入：10×退火缓冲液3μL，两种寡核苷酸片段各13.5μL.加热至95℃，于37℃恒温孵箱内放置2h.

6、退火产物与线性化的pSilencerTM3.1H1neo载体连接，之后转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，选取载体中的EcoRI酶切位点和克隆片断中的HindⅢ酶切位点进行双酶切，鉴定片段是否插入目的载体中，选取阳性克隆由上海生工生物工程技术公司进行测序，以确定其是否为目的片段.同时设计非特异性序列：5′TTCTCCGAACGTGTCACGT3′，与人类基因无同源性，可以作为阴性对照.1.2.2细胞转染将人宫颈癌细胞系HeLa以5×105/孔接种于6孔细胞培养板，37℃，50mL/LCO2培养箱培养24h，当细胞长至80%汇合时进行转染.转染操作方法按

7、照LipfectamineTM2000说明书进行，转染48h后收取细胞样品，用于RTPCR和蛋白印迹检测.1.2.3RTPCR检测运用软件PrimerPremier5.0针对miz1基因的cDNA设计引物，其上游引物为：5′gatgacatggtcacgctggctacc3′，下游引物为：5′gcatgtgcgaatccacacagccca3′，产物为248bp的片段.针对gapdh的cDNA设计引物，其上游引物为：5′gcctcaagatcatcagcaat3′，下游引物为：5′aggtccaccactgacacgtt3′，产物为3

8、07bp的片段.按Trizol试剂盒操作说明提取转染所得细胞的总RNA，紫外分光