miz1基因sirna表达载体的构建及影响hela细胞对阿霉素的敏感性的论文

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1、miz1基因siRNA表达载体的构建及影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性的论文作者：刘学武,沈岚,张健,刘新平【摘要】目的：构建针对转录因子miz1基因的sirna表达载体，观察其影响hela细胞对阿霉素的敏感性.方法：设计并合成针对miz1基因的sirna寡核苷酸，克隆入sirna表达载体,脂质体瞬时转染入hela细胞中,用rtpcr检测miz1基因的mrna表达水平,用iz1蛋白表达水平，用mtt法检测hela细胞活力.结果：dna测序和酶切鉴定证明针对miz1基因的sirna表达载体构建成功，rtpcr和iz1基因的mrna表达和蛋白表达.与对照组相比

2、，转染上述干扰载体后的hela细胞，在加入阿霉素12h后,细胞活力明显降低（p<0.05），并且干扰质粒与阿霉素存在交互作用（p<0.05），以加入阿霉素12h和24h后最明显.结论：针对miz1基因的sirna能够抑制人宫颈癌细胞系hela中miz1基因的表达并能增强hela细胞对阿霉素的敏感性.【关键词】转录因子miz1；rna干涉；转染；阿霉素0引言化疗是肿瘤治疗的常规手段，拓扑异构酶ⅱ抑制剂阿霉素作为常用的化疗药物之一，其能引起dna断裂，诱导细胞凋亡，并且这一作用与靶细胞内某些基因如cmyc的表达水平密切相关.miz1为myc相互作用的

3、锌指蛋白，属于pozzf转录因子家族成员［1］.目前发现miz1能调节细胞的增殖和分化［2］，并与细胞凋亡密切相关［3］.在辐射引起细胞dna损伤时，miz1的敲弱可使细胞从g1期阻滞走向凋亡［4］，当阿霉素引起dna损伤并诱导细胞凋亡时，miz1的表达异常可能会影响阿霉素对靶细胞的杀伤效果.为探讨miz1的表达与肿瘤细胞对阿霉素敏感性的关系，我们采用rnai技术，构建了针对miz1的sirna的表达载体转染入人宫颈癌细胞系hela,通过半定量rtpcr以及免疫印迹检测内源性miz1的表达并采用mtt法检测hela细胞的活力，为进一步研究miz1影响肿瘤细

4、胞对阿霉素的敏感性机制提供依据.1材料和方法1.1材料psilencertm3.1h1neo载体（美国ambion公司）；rna反转录试剂(美国promega公司)；各种限制性内切酶，t4dna连接酶和pcr试剂（美国gibco公司）；dna提取及回收试剂盒（上海华舜公司）；lipofectamim2000（美国invitrogen公司）；odyssey红外荧光扫描成像系统（美国licor公司）；大肠杆菌dh5α菌种，人宫颈癌细胞系hela（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存）；寡核苷酸片段（上海基康生物技术有限公司合成）；抗miz1抗体（美国sa

5、ntacruz公司）；irdyetm800红外荧光标记的羊抗兔二抗（美国rockland公司）.1.2方法1.2.1psilencertm3.1h1neomiz1基因载体的构建针对转录因子miz1基因的编码区选取19个核苷酸作为sirna作用靶点,设计并合成两条寡核苷酸片段，5′gatcccgccttacctgtgtgataagttcaagagacttatcacacaggtaaggcttttttggaaa3′及5′agcttttccaaaaaagccttacctgtgtgataagtctcttgaacttatcacacaggtaaggcgg3′，其

6、中gatcc为bamhⅰ酶切位点，agctt为hindⅲ酶切位点,gccttacctgtgtgataag为设计的sirna序列，ttcaagaga转录后形成发夹环.将上述两条寡核苷酸片段分别溶于双蒸水中至终浓度为50pmol/l.30μl退火体系中加入：10×退火缓冲液3μl，两种寡核苷酸片段各13.5μl.加热至95℃，于37℃恒温孵箱内放置2h.退火产物与线性化的psilencertm3.1h1neo载体连接，之后转化大肠杆菌dh5α，提取质粒，选取载体中的ecori酶切位点和克隆片断中的hindⅲ酶切位点进行双酶切，鉴定片段是否插入目的载体中，选取阳性

7、克隆由上海生工生物工程技术公司进行测序，以确定其是否为目的片段.同时设计非特异性序列：5′ttctccgaacgtgtcacgt3′，与人类基因无同源性，可以作为阴性对照.1.2.2细胞转染将人宫颈癌细胞系hela以5×105/孔接种于6孔细胞培养板，37℃，50ml/lco2培养箱培养24h，当细胞长至80%汇合时进行转染.转染操作方法按照lipfectamim2000说明书进行，转染48h后收取细胞样品，用于rtpcr和蛋白印迹检测.1.2.3rtpcr检测运用软件primerpremier5.0针对miz1基因的cdna设计引物，其上游引物为：5

8、′gatgacatggtcacgct