短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对凝血功能的影响

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1、短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对凝血功能的影响作者：黎渊弘钟小斌，林发全,李明芬,黎肇炎【摘要】目的研究短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外的抗凝作用及机制。方法按试剂盒说明进行磷脂结合抗凝蛋白对活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原（FIB）含量、凝血因子活性、组织凝血活酶抑制实验(TTI)和稀释的罗氏蝰蛇毒时间(DRVVT)、血小板聚集功能以及溶血、出血实验。结果磷脂结合抗凝蛋白能显著地延长活化部分凝血活酶时间和稀释的罗氏蝰蛇毒时间，减少组织凝血活酶抑制实验(TTI)试剂的磷脂浓度,能加速其抗凝作用,干扰Ⅷ，Ⅸ，Ⅺ，Ⅻ

2、因子活性，未见溶血和出血。其抗凝活性与磷脂结合有关，可能通过内源性途径抑制凝血过程。结论短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白能够抗凝、抑制Ⅷ，Ⅸ，Ⅺ，Ⅻ因子活性并与磷脂结合，可通过内源性途径抑制凝血过程。【关键词】抗凝血；磷酯；蛇毒Abstract:ObjectiveTostudyanticoagulationeffectsofPhospholipid-bindinganticoagulationprotEin(PBAP)fromAgkistrodonhalysBrevicaudusVenom.MethodsTheactivatedpartialthromboplastinti

3、me(APTT),Prothrombintime(PT),Fibrinogen(FIB),Thrombintime(TT)andFactoractivityinedbykitillustration.TheTTItestedaccordingtothemethodofSchlEIder.ThedRVVTtestercialkitsacoordingtothemanufacturer'siustrution.ResultsoredAgkistrodonhalysBrevicaudusVenomcouldmarkedlyprolongAPTTandDRVVT(P<0

4、.01)concentration-dependentbuttime-independentmanner,accentuatetheinhibitoreffectofTTⅠbydecreasingphospholipidconcentration.andinhibittheactivitiesofFⅧ：C，FⅨ:C，FⅪ:C，FⅫ:C.ConclusionThePhospholipid-bindinganticoagulationproteinfromtheAgkistrodonhalysBrevicaudusVenomcananticoagulateandinhib

5、itFⅧ:C，FⅨ:C，FⅪ:C，FⅫ:CactivityandbindPhospholipid.Key蛇毒中常有的抗凝蛋白分为蛋白水解酶类和非蛋白水解酶,它们作用的有效成分和性质已被广泛研究。然而，蛇毒中磷酯结合抗凝蛋白（Phospholipid-bindinganticoagulationprotein，PBAP)对凝血功能的作用尚未见报道。笔者已报道从短尾蝮蛇毒中纯化出一种能与磷酯结合的新型抗凝蛋白［1］。该蛋白是二聚体,相对分子量为24.0×103(非还原)和14.6×103(还原)。等电点为pH5.2。N-末端为DCPS(D/G)edical公司购买；牛凝血

6、酶和人凝血酶和其他试剂均为国产分析纯。LambdaBio20双光束紫外分光光度计，美国PE公司产品；Allegra64R台式高速离心机，美国Beckman公司产品。ACL-Advace全自动血凝仪，美国IL公司产品。新西兰白兔(2.0±0.5)kg，SD大鼠(200±20)g，小鼠(18±2)g(清洁级,广西医科大学实验动物中心)。2方法2.1APTT，PT，TT及FIB含量测定2.1.1体外法0.2mg/ml的抗凝蛋白0.1ml(对照组为生理盐水)，分别加入用30份正常的人血浆制成的混合血浆4，6，8，配置成1∶40，1∶60，1∶803个不同稀释浓度,每一稀释浓度

7、取50μl，然后按APTT，PT，TT，FIB试剂盒说明，在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行。2.1.2体内法新西兰白兔24只，随机分为磷脂结合抗凝蛋白高、中、低剂量组和肝素组。各兔于耳缘静脉按0.8，0.4，0.2mg/kg给药,肝素组剂量为50U/kg,药前及药后15min分别从耳动脉取血2ml，用3.8%枸橼酸钠9∶1抗凝，3000r/min离心10min，分离贫血小板血浆，按APTT，PT，TT试剂盒说明，在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行测定。2.2凝血因子活性的测定2.2.1体外法0.2mg/ml的抗凝