原发性肝细胞癌病人pbmcs中hbv x、p基因的整合论文

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1、原发性肝细胞癌病人PBMCs中HBVX、P基因的整合论文王淑霞闫志勇王力秋赵海燕刘成玉王斌【关键词】癌,.freelarylivercancer（PLC）andintegrationofHBVXgeneandPgeneinperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）inPLCpatients.MethodsPrimersX1，X2isolatedPBMCsin40PLCpatientsinetheintegrationofHBVPandXgene.ResultsTheintegrat

2、ionofXgeneandPgeneononuclearcells，andtheexpressionofXgeneplaysamajorroleintheoccurrenceofprimarylivercancer.［KEYCs）［1，2］。人体感染HBV后可导致病毒携带者、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、爆发性肝衰竭等不同临床类型，部分慢性乙型肝炎可发展为肝硬化，大约30%～40%的肝硬化病人最终可发展为肝细胞癌（HCC）。尽管HCC发生的分子生物学机制尚不十分明确，但已确定慢性乙型肝炎病毒感染为HCC的主要致病因素

3、，HBV感染者发展为HCC的危险性是未感染者的100倍以上［3］。研究认为，HBV感染可能通过多种途径引起HCC发生，其中HBVDNA整合于肝细胞基因组是HCC发生的主要机制之一;此外，也有研究发现HBV基因可以整合于PBMCs中［4］。本文采用PCR检测PBMCs中HBVX、P基因的整合情况，以探讨它们与HCC的关系，现报告如下。1资料与方法1.1研究对象临沂市人民医院2003～2004年住院确诊的HBsAg阳性的原发性HCC病人40例，男34例，女6例;年龄38～72岁，平均（56.3±7.3）岁。其中Ⅰ期3例

4、，Ⅱ期15例，Ⅲ期22例。5例HBsAg阴性的原发性HCC病人和5例HBsAg阴性的健康体检者作阴性对照和健康对照。1.2主要试剂DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶均为Pro-mega公司产品;无RNase的DNaseⅠ为Sigma公司产品;引物由上海生工公司合成。1.3PBMCs的分离和细胞中基因组DNA提取所有研究对象均于早晨无菌抽取空腹静脉血5mL，置于EDTA抗凝的无菌试管中，4℃保存运输，标本收集后4h内使用低渗溶解红细胞法提取全血中PBMCs。使用Promega公司的DNA提取试剂盒提取1mL全血PB

5、MCs中的细胞基因组DNA。1.4引物设计从GenBank获得多株HBV的P基因及X基因全序列，用DNAStar软件分析编码DNA多聚酶-逆转录酶P基因的高保守序列及包含DR2在内的X基因序列，分别设计P、X基因的上、下游引物，序列见表1。表1P、X基因的上、下游引物序列（略）1.5PCR检测X、P基因在PBMCs基因组中的整合情况以X1、X2及P1、P2为引物，以DNA为模板行PCR检测。总反应体系25μL（模板3μL，10×buffer2.5μL，Mg2+2.5μL，4×dNTP2μL，10×上下游引物各2μL

6、，TaqDNA聚合酶0.4μL，ddH2O10.6μL）;扩增条件:94℃变性5min后，94℃45s，50℃45s，72℃1min，共35个循环，然后72℃延伸5min。1.6统计学处理采用青岛大学医学院周晓斌等设计的PPMs1.5软件进行χ2检验。2结果2.1PBMCs基因组中HBVX、P基因整合情况HBVX基因整合阳性标本扩增产物长度约为222bp（图1）;HBVP基因整合阳性标本扩增产物长度约为379bp（图2），均与预测结果一致。2.2HCC病人PBMCs中HBVX、P基因整合率HCC病人PBMCs中X基

7、因片段的整合率为77.5%（31/40），P基因片段的整合率为15.0%（6/40），差别有极显著意义（χ2=31.43，P0.001）。HCC的Ⅰ、Ⅱ期X基因整合率为72.2%（13/18），P基因整合率为11.1%（2/18）;Ⅲ期X基因整合率为81.8%（18/22），P基因整合率为18.2%（4/22），Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期比较，X、P基因整合率差别均无统计学意义（χ2=0.117、0.032，P0.05）。3讨论肝细胞癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，病死率在恶性肿瘤中居第3位［5］。与逆转录病毒相似，HBV整合于

8、肝细胞是肝细胞发生恶变的基础，整合的HBV基因组可在不同的环节参与细胞的癌变，可能作用于癌变的起始或持续感染使肝细胞坏死和再生，促成细胞的癌变;又有可能干扰正常宿主基因的功能，使癌变进展。图1PBMCs基因组中整合的HBVX基因（略）M为DL2000DNAMarker;①～③HCC扩增产物;④健康对照;⑤阳性对照;⑥阴性对照图2PBMCs基因组中整合的HBV