原发性肝细胞癌病人pbmcs中hbv x、p基因的整合

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1、原发性肝细胞癌病人PBMCs中HBVX、P基因的整合【关键词】癌,肝细胞;肝炎病毒,乙型;基因;病毒整合　　［摘要］目的探讨外周血单个核细胞（PBMCs）中乙型肝炎病毒（HBV）X、P基因整合与原发性肝细胞癌（HCC）的关系。方法分离HBsAg阳性的40例原发性肝癌病人PBMCs，提取基因组DNA;分别设计HBVX基因、P基因PCR引物，检测HCC病人PBMCs基因组中HBV的X基因和P基因的整合情况。结果HCC病人X基因在PBMCs中的整合率为77.5%（31/40），P基因整合率为15.0%（6/4

2、0），二者差异有显著性（χ2=31.43，P<0.001）。结论PBMCs中存在HBVX、P基因的整合，X基因片段的整合及表达是HCC发生的主要因素。　　［关键词］癌，肝细胞;肝炎病毒，乙型;基因;病毒整合　　　［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetherelationshipbetarylivercancer（PLC）andintegrationofHBVXgeneandPgeneinperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）inPL

3、Cpatients.MethodsPrimersX1，X2isolatedPBMCsin40PLCpatientsinetheintegrationofHBVPandXgene.ResultsTheintegrationofXgeneandPgeneononuclearcells，andtheexpressionofXgeneplaysamajorroleintheoccurrenceofprimarylivercancer.　　［KEYCs）［1，2］。人体感染HBV后可导致病毒携带者、急性乙型肝炎、

4、慢性乙型肝炎、爆发性肝衰竭等不同临床类型，部分慢性乙型肝炎可发展为肝硬化，大约30%～40%的肝硬化病人最终可发展为肝细胞癌（HCC）。尽管HCC发生的分子生物学机制尚不十分明确，但已确定慢性乙型肝炎病毒感染为HCC的主要致病因素，HBV感染者发展为HCC的危险性是未感染者的100倍以上［3］。研究认为，HBV感染可能通过多种途径引起HCC发生，其中HBVDNA整合于肝细胞基因组是HCC发生的主要机制之一;此外，也有研究发现HBV基因可以整合于PBMCs中［4］。本文采用PCR检测PBMCs中HBVX、

5、P基因的整合情况，以探讨它们与HCC的关系，现报告如下。　　1资料与方法　　1.1研究对象临沂市人民医院2003～2004年住院确诊的HBsAg阳性的原发性HCC病人40例，男34例，女6例;年龄38～72岁，平均（56.3±7.3）岁。其中Ⅰ期3例，Ⅱ期15例，Ⅲ期22例。5例HBsAg阴性的原发性HCC病人和5例HBsAg阴性的健康体检者作阴性对照和健康对照。　　1.2主要试剂DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶均为Pro-mega公司产品;无RNase的DNaseⅠ为Sigma公司产品;引物由上海

6、生工公司合成。　　1.3PBMCs的分离和细胞中基因组DNA提取所有研究对象均于早晨无菌抽取空腹静脉血5mL，置于EDTA抗凝的无菌试管中，4℃保存运输，标本收集后4h内使用低渗溶解红细胞法提取全血中PBMCs。使用Promega公司的DNA提取试剂盒提取1mL全血PBMCs中的细胞基因组DNA。　　1.4引物设计从GenBank获得多株HBV的P基因及X基因全序列，用DNAStar软件分析编码DNA多聚酶-逆转录酶P基因的高保守序列及包含DR2在内的X基因序列，分别设计P、X基因的上、下游引物，序列见

7、表1。　　　　表1P、X基因的上、下游引物序列（略）　　1.5PCR检测X、P基因在PBMCs基因组中的整合情况以X1、X2及P1、P2为引物，以DNA为模板行PCR检测。总反应体系25μL（模板3μL，10×buffer2.5μL，Mg2+2.5μL，4×dNTP2μL，10×上下游引物各2μL，TaqDNA聚合酶0.4μL，ddH2O10.6μL）;扩增条件:94℃变性5min后，94℃45s，50℃45s，72℃1min，共35个循环，然后72℃延伸5min。　　1.6统计学处理采用青岛大学医学院

8、周晓斌等设计的PPMs1.5软件进行χ2检验。　　2结果　　2.1PBMCs基因组中HBVX、P基因整合情况HBVX基因整合阳性标本扩增产物长度约为222bp（图1）;HBVP基因整合阳性标本扩增产物长度约为379bp（图2），均与预测结果一致。　　2.2HCC病人PBMCs中HBVX、P基因整合率HCC病人PBMCs中X基因片段的整合率为77.5%（31/40），P基因片段的整合率为15.0%（6/40），差别有极显著意义（χ2=31.4