ctgf反义寡核苷酸对angⅱ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响论文

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1、CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响论文陈珑，刘必成，马坤岭，刘宏，罗冬冬目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管细胞转分化的可能影响。方法：采用体外培养的人近曲肾小管上皮细胞株（HK2），分别观察CTGF反义寡核苷酸和AngⅡ干预细胞对细胞CTGFmRNA和蛋白质的表达、细胞内超微结构及细胞α平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达的影响。结果:AngⅡ干预HK2细胞48h后，细胞CTGFmRNA和蛋白的表达显著增高（P＜0.01）；AngⅡ干预96h后，细

2、胞超微结构显示出间质细胞样结构；这些作用都可被CTGF反义寡核苷酸显著抑制。AngⅡ可以呈时间依赖性地刺激HK2细胞表达αSMA.freelRNAandproteinexpressionicroscopyrespectively.TheeffectofCTGFASonAngⅡinducedcellularultrastructureissiveelectronicmicroscope(TEM).Theexpressionofαsmoothaction(αSMA)munocytochemistry.Thecontrolgroupb

3、ledoligonucleotide(SC).ResultsItRNAandprotein(P＜0.01,respectively).Ifthecellsulatedesenchymalfeatures.AndtheseeffectscouldbepartiallyattenuatedbyCTGFAS.AngⅡsignificantlystimulatedtheexpressionofαSMAinatimedependentmanner,arkedlyattenuatedbythetreatmententightbeinvolv

4、edintheAngⅡinducedtubularcellEMT.Keyanproximaltubularcell;angiotensinⅡ;connectivetissuegros（Cardiff,UK）惠赠。细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养液培养，每日换液1次，2～3d传代1次。1.2主要试剂低糖型DMEM培养基（GIBCO公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），AngⅡ(Sigma公司)，CTGF反义寡核苷酸、错义寡核苷酸（全硫代磷酸化，上海捷倍思基因技术有限公司合成）。CTGF反义寡核苷酸（CTGFAS

5、）序列（按文献［3］选取）：5′TACTGGCGGCGGTCAT3′；错义寡核苷酸(SC)：5′GGTCTAGCTTGCGGAC3′。TRIPURERNA提取液（GIBCOL公司）。CTGF的PCR引物（按文献［4］选取），上游引物5′GAGGAAAACATTAAGAAGGGCAAA3′，下游引物5′CGGCACAGGTCTTGATGA3′,选取GAPDH为内参照。山羊抗人CTGF多克隆抗体（RD公司），FITC标记兔抗山羊IgG（北京中山生物技术有限公司），鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），超敏SP试剂盒、

6、AEC显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。1.3实验分组实验分4组：A组为正常对照组，B组为AngⅡ（10-7molL-1）组，C组为AngⅡ（10-7molL-1）加CTGFAS（20μgml-1）组，D组为AngⅡ（10-7molL-1）加SC（20μgml-1）组。1.4研究方法1.4.1RTPCR用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤各组细胞后，加入TRIPURERNA提取液，按说明书步骤提取总RNA。用紫外分光光度计测260、280nm吸光值，重复3次，计算A260nm/A280nm值。按RTPCR操作步骤操作，总反应体

7、系为50μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃扩增1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸8min。取CTGF和GAPDH的PCR产物各5μl，1.7％的琼脂糖凝胶电泳，用ImageMasterVDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。用TotalLab分析软件对PCR条带进行密度扫描分析，目的片段和GAPDH的比值作为实验数据。实验重复3次。1.4.2激光共聚焦显微镜细胞行免疫荧光化学染色，一抗为山羊抗人CTGF多克隆抗体,1∶100；荧光二抗为FITC标记兔抗山羊IgG,1∶50。PBS代替一抗作为阴性对

8、照。CTGF染色模式为胞浆着色，共聚焦显微镜下阳性细胞胞浆呈淡绿色或绿色荧光。使用LSM510Version2.3软件分析荧光强度。1.4.3透射电镜分析技术收集细胞，胰蛋白酶消化，然后以2000rmin-1离心15～20min，弃上清，加入4℃预冷的2％戊二醛