欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:25232086
大小:62.50 KB
页数:10页
时间:2018-11-19
《ctgf反义寡核苷酸对angⅱ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响论文》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的影响论文陈珑,刘必成,马坤岭,刘宏,罗冬冬目的:探讨结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小管细胞转分化的可能影响。方法:采用体外培养的人近曲肾小管上皮细胞株(HK2),分别观察CTGF反义寡核苷酸和AngⅡ干预细胞对细胞CTGFmRNA和蛋白质的表达、细胞内超微结构及细胞α平滑肌肌动蛋白(αSMA)表达的影响。结果:AngⅡ干预HK2细胞48h后,细胞CTGFmRNA和蛋白的表达显著增高(P<0.01);AngⅡ干预96h后,细
2、胞超微结构显示出间质细胞样结构;这些作用都可被CTGF反义寡核苷酸显著抑制。AngⅡ可以呈时间依赖性地刺激HK2细胞表达αSMA.freelRNAandproteinexpressionicroscopyrespectively.TheeffectofCTGFASonAngⅡinducedcellularultrastructureissiveelectronicmicroscope(TEM).Theexpressionofαsmoothaction(αSMA)munocytochemistry.Thecontrolgroupb
3、ledoligonucleotide(SC).ResultsItRNAandprotein(P<0.01,respectively).Ifthecellsulatedesenchymalfeatures.AndtheseeffectscouldbepartiallyattenuatedbyCTGFAS.AngⅡsignificantlystimulatedtheexpressionofαSMAinatimedependentmanner,arkedlyattenuatedbythetreatmententightbeinvolv
4、edintheAngⅡinducedtubularcellEMT.Keyanproximaltubularcell;angiotensinⅡ;connectivetissuegros(Cardiff,UK)惠赠。细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养液培养,每日换液1次,2~3d传代1次。1.2主要试剂低糖型DMEM培养基(GIBCO公司),新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所),AngⅡ(Sigma公司),CTGF反义寡核苷酸、错义寡核苷酸(全硫代磷酸化,上海捷倍思基因技术有限公司合成)。CTGF反义寡核苷酸(CTGFAS
5、)序列(按文献[3]选取):5′TACTGGCGGCGGTCAT3′;错义寡核苷酸(SC):5′GGTCTAGCTTGCGGAC3′。TRIPURERNA提取液(GIBCOL公司)。CTGF的PCR引物(按文献[4]选取),上游引物5′GAGGAAAACATTAAGAAGGGCAAA3′,下游引物5′CGGCACAGGTCTTGATGA3′,选取GAPDH为内参照。山羊抗人CTGF多克隆抗体(RD公司),FITC标记兔抗山羊IgG(北京中山生物技术有限公司),鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司),超敏SP试剂盒、
6、AEC显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。1.3实验分组实验分4组:A组为正常对照组,B组为AngⅡ(10-7molL-1)组,C组为AngⅡ(10-7molL-1)加CTGFAS(20μgml-1)组,D组为AngⅡ(10-7molL-1)加SC(20μgml-1)组。1.4研究方法1.4.1RTPCR用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤各组细胞后,加入TRIPURERNA提取液,按说明书步骤提取总RNA。用紫外分光光度计测260、280nm吸光值,重复3次,计算A260nm/A280nm值。按RTPCR操作步骤操作,总反应体
7、系为50μl。反应条件为:94℃预变性5min;94℃扩增1min,55℃1min,72℃1min,35个循环;72℃延伸8min。取CTGF和GAPDH的PCR产物各5μl,1.7%的琼脂糖凝胶电泳,用ImageMasterVDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。用TotalLab分析软件对PCR条带进行密度扫描分析,目的片段和GAPDH的比值作为实验数据。实验重复3次。1.4.2激光共聚焦显微镜细胞行免疫荧光化学染色,一抗为山羊抗人CTGF多克隆抗体,1∶100;荧光二抗为FITC标记兔抗山羊IgG,1∶50。PBS代替一抗作为阴性对
8、照。CTGF染色模式为胞浆着色,共聚焦显微镜下阳性细胞胞浆呈淡绿色或绿色荧光。使用LSM510Version2.3软件分析荧光强度。1.4.3透射电镜分析技术收集细胞,胰蛋白酶消化,然后以2000rmin-1离心15~20min,弃上清,加入4℃预冷的2%戊二醛
此文档下载收益归作者所有