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1、白介素12重组腺病毒载体的构建及其抗肿瘤作用初步观察论文鞠全荣黄丽华张孝卫杜德田耿秀兰刘宗印马力张如胜任东俊【摘要】［目的］构建携带小鼠白细胞介素12腺病毒载体（AdCMVmIL,12），并观察其对H22肿瘤的抑瘤效果。［方法］构建重组质粒pdlE1SP1BmIL,12，并用该质粒与质粒pJM17共转染293细胞后包装而成AdCMVmIL,12，并进行酶切法鉴定。同时制备肿瘤动物，通过肿瘤内局部注射AdCMVmIL,12，观察其抗肿瘤作用。［结果］酶切鉴定显示构建正确，其病毒滴度为1.3×109pfu/ml；当病毒滴度为100MOI时，mIL,
2、12浓度达到3417ng/1×106细胞/24h。动物实验表明.freelIL,12的小鼠，肿瘤体积明显小于对照组（P0.01），生存期显著延长。［结论］构建AdCMVmIL,12成功，肿瘤内局部注射可发挥抗肿瘤作用。【关键词】白细胞介素12重组腺病毒基因表达肿瘤小鼠1材料与方法1.1材料与试剂菌株、细胞株和质粒：大肠杆菌DH5α，质粒pCDNA/amp/mIL,12/p35，pCDNA/amp/mIL,12/p40，pCA13，pdlE1SP1B，pJM17，大鼠髓质甲状腺癌细胞（rMTC）由美国芝加哥大学提供；人胚肾293细胞由第二军医大学
3、提供；T4DNA连接酶（Invitrogen），限制性内切酶HindⅢ,Xhol,EcoRⅤ，BglⅡ(TaKaRa)，RNA酶抑制剂（北京华美公司）；昆明种小鼠购自山东大学动物中心，许可证号为SCXY（鲁）20030004；H22由本室保存。1.2方法1.2.1质粒制备用感受态大肠杆菌DH5α常规方法扩增质粒pCDNA/amp/mIL,12/p35、pCDNA/amp/mIL,.freelIL,12的构建：用HindⅢ、Xhol酶切pCDNA/amp/mIL,12/p40，并将其插入HindⅢ、Xhol酶切后的pCA13中，获得pCA13mI
4、L,12/p40；同法用HindⅢ和EcoRⅤ酶切pCDNA/amp/mIL,12/p35，并将其插入HindⅢ、EcoRⅤ酶切后的pCA13中，获得pCA13mIL,12/p35；将BglⅡ酶切pCA13mIL,12/p40并补平粘端所得小片段与EcoR1酶切pdlE1SP1B并补平粘端所得大片段通过T4DNA连接酶连接，得到pdlE1SP1BmIL,12/p40；将BglⅡ酶切pdlE1SP1BmIL,12/p40所得大片段和BglⅡ酶切pCA13mIL,12/p35所得小片段连接，得到pdlE1SP1BmIL,12。重组的pdlE1SP1
5、BmIL,12/p40/p35分别含有两个CMV启动子和两个SV40终止信号。用pdlE1SP1BmIL,12转染293细胞，包装并扩增出AdCMVmIL,12。包装过程：在1ml无血清培养基中加入5μl脂质体（LIPOFECTAMINE）、8μgpJM17及4μgpE1SP1BmIL,12，上述混合液室温放置15min。弃去细胞培养液，用无血清DMEM培养基洗两遍，加入上述混合液，置37℃的CO2培养箱中孵育3~4h，再加入含20%胎牛血清的DMEM，CO2培养箱中37℃培养。第二天将细胞分至3个培养皿，继续培养，隔天补充0.5ml含10%胎
6、牛血清的DMEM，注意观察细胞病变效应（CPE）的出现。包装好的腺病毒为AdCMVmIL,12。转染前正常293细胞呈梭状，连接成片。转染后293细胞固缩成团、部分细胞裂解。1.2.2对重组腺病毒鉴定用限制性内切酶HindⅢ和Xhol对重组腺病毒DNA进行常规酶切鉴定。1.2.3重组腺病毒的扩增和滴度测定取经酶切鉴定正确的AdCMVmIL,12感染293细胞，大量扩增AdCMVmIL,12。将扩增后的病毒液做倍比稀释，在96孔板上感染293细胞进行病毒滴定，观察每孔中的细胞病变效应（CPE）。以出现CPE的最高稀释度为病毒滴度。1.2.4AdC
7、MVmIL,12的生物学活性检测取1×106大鼠髓质甲状腺癌细胞（rMTC），用500μl滴度为100MOI（感染复数）的AdCMVmIL,12感染1h，被感染的细胞经过无血清培养基洗3遍后在96孔板上培养。24h后收集上清（内含mIL,12）待检测。同时用重组mIL,12作为阳性对照，用含有荧光素基因重组腺病毒（AdCMVLuc）感染后的rMTC培养上清作阴性对照。1.2.5AdCMVmIL,12抑瘤性实验注射1×106个H22细胞于昆明种小鼠皮下，并在长成的瘤体内分别注射AdCMVLuc和AdCMVmIL,12（含1×109pfu）稀释液。
8、注射当天为0天，每隔1天观察1次肿瘤生长情况，并用卡尺测量肿瘤最小直径（a）和最大直径（b），按照公式（V=a2·b/2）计算肿瘤体积。观察AdCMV
