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1、凝血酶预处理对海马神经元的保护作用作者：杨文琼,孙圣刚,童萼塘 [摘要] 目的:研究凝血酶预处理（TPC）对大剂量凝血酶（TM）诱导海马神经元凋亡的影响，阐明TPC的保护作用。方法:海马神经元分别经生理盐水（Sham组）、小剂量TM（TPC组）及凝血酶受体激活肽（TRAP组）预处理48h后再加大剂量TM作用24h。TUNEL法及流式细胞术检测凋亡细胞数和凋亡百分率，应用免疫细胞化学方法检测神经元Bcl-2及Bax蛋白表达。结果:与Sham组比较，TPC组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低（P<0.01），Bcl-2表达上调，Bax表达明显下调（P<0.01）。与S
2、ham组比较，TRAP预处理组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低（P<0.01），Bcl-2表达上调，Bax表达明显下调（P<0.01）。TRAP预处理组与TPC组相比差异无显著性（P>0.05）。结论:TPC可抑制TM导致的神经细胞凋亡，激活PAR-1，促进Bcl-2的表达和降低Bax的表达，可能是TPC抑制细胞凋亡的机制之一。 [关键词] 凝血酶预处理；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；蛋白酶激活受体-1 TheEffectofThrombinPreconditioningontheApoptosisofHippocampalNeurons Abs
3、tract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofthrombinpreconditioning（TPC）ontheapoptosisofhippocampalneuronsandexplorethepotentialmechanisms.MethodsHippocampalneuronslTMand5μmol/Lthrombinreceptoractivatingpeptides（TRAP）for48hbeforeexposedto40U/mlTM,respectively.Thenumberofapoptoticcellsandapoptoticrat
4、eofneuronseasuredbyterminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)mediateddUTP-biotinnickend-labeling（TUNEL）methodandFloetry.Bcl-2andBaxprotEinexpressioneasuredbyimmuocytochemicalmethod.ResultsThenumberofapoptoticcellsandapoptoticrateofneuronsgroup,thenumberofapoptoticcellsandapoptoticrateofneuronsech
5、anismofneuroprotectiveeffectofTPCmaybethroughactivatingPAR-1,up-regulatingBcl-2proteinexpressionanddobinpreconditioning;Apoptosis;Bcl-2;Bax;Proteaseactivatedreceptor-1 作为血肿成分中最特殊的物质，凝血酶在脑出血脑损伤中的作用倍受关注[1]。研究发现，虽然大剂量凝血酶可导致脑损伤和细胞凋亡，但低浓度的凝血酶却具有神经保护作用。经过小剂量凝血酶预处理后，凝血酶和脑内血肿所致的脑水肿可减轻，大鼠大脑中动脉梗塞模型中的梗塞面
6、积明显减小[2,3]，这种现象被称为凝血酶预处理（ThrombinPreconditioning,TPC）或凝血酶诱导的脑耐受。为了探讨凝血酶预处理的神经保护机理，本实验采用小剂量凝血酶预处理原代培养的海马神经元，结合TUNEL法、流式细胞术及免疫细胞化学等方法，研究凝血酶预处理的保护作用及其机制。 1 材料和方法 1.1 材料新生SD大鼠80只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供),凝血酶（Sigma公司）,凝血酶受体激活肽（TRAP，武汉协和医院心血管研究所合成），DMEM培养基,B27促生长剂（Gibco），神经元特异性烯醇化酶（NSE），Bcl-2、Bax小鼠单克
7、隆抗体（SantaCruz）,TUNEL试剂盒（Roche公司）,SP免疫组织化学试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 新生大鼠海马神经元原代培养:取1d新生SD大鼠速冻3~5min,消毒后于超净工作台内,开颅取全脑,立即置于冰冷的无菌解剖液中,分离海马,切碎,置终浓度0.125%胰酶,37℃,5%CO2培养箱内消化30min。适量完全培养基（DMEM+10%胎牛血清+10%马血清）终止消化,过滤，离心后沉淀用完全培养基稀
