survivin及 bcl2基因表达在胃癌细胞株mgc803顺铂耐药中的作用论文

《survivin及 bcl2基因表达在胃癌细胞株mgc803顺铂耐药中的作用论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、survivin及bcl2基因表达在胃癌细胞株MGC803顺铂耐药中的作用论文【摘要】目的探讨胃癌细胞株MGC803对顺铂（CDDP）耐药产生的有关机制。方法观察不同浓度CDDP(0.1、1.0、10.0mg/L)对MGC803细胞增殖、凋亡及抗凋亡基因survivin，bcl2mRNA表达的影响，用MTT法检测细胞生长抑制率；荧光染色检测细胞凋亡率；流式细胞仪测定细胞周期的变化；RTPCR检测survivin、bcl2mRNA的表达。结果10mg/L的CDDP对MGC803细胞有较强的抑制增殖、促进凋亡

2、作用，而0.1、1.0mg/L的CDDP干预24h后，其抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用逐渐消失；CDDP作用于细胞48h后，细胞S期增加，G2/M期下降；MGC803细胞在1.0mg/L的CDDP作用下.freelRNA表达自24h后逐渐增高，bcl2mRNA表达逐渐下降(P＜0.05)。结论CDDP可干扰MGC803细胞周期，但该细胞对低浓度CDDP易于产生耐药，survivinmRNA表达增高可能是MGC803细胞对CDDP产生耐药原因之一。【关键词】胃癌细胞株顺铂耐药细胞凋亡survivinbcl2胃

3、癌是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率居各类恶性肿瘤之首，化疗作为胃癌的重要治疗手段之一，其疗效仍不令人满意，原因主要与癌细胞耐药有关。为此，本实验参照文献1,将胃癌常用化疗药物顺铂（Cisplatin,CDDP）设为三个不同作用浓度，通过检测MGC803细胞在顺铂作用过程中细胞周期，细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因survivin、bcl2mRNA的表达变化，探讨胃癌细胞对细胞毒性药物顺铂耐药的产生及可能机制。1材料与方法1.1药物与试剂RPMI1640培养液，Trizol（GibcoBRL公司）；小牛血清（杭州四季青

4、公司），四噻唑蓝（MTT）、溴已定（EB）、丫啶橙（AO）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司），survivin、bcl2引物2(上海生工合成)；βactin（上海瑞科公司）；二步法RTPCR试剂：Taq酶、oligodT、dNTP、DEPC（Sangon公司），MNLV、Rnasin（Promeg公司），CDDP（山东齐鲁制药厂，生理盐水溶解，培养液稀释）。1.2实验方法1.2.1细胞培养及传代人胃低分化腺癌细胞株MGC803购自湘雅医学院细胞中心。细胞于含青霉素100U/L，链霉素100mg/

5、L，10％灭活小牛血清的RPMI1640培养液中,置37℃，5％CO2培养箱内培养。1.2.2MTT比色法测定药物对细胞增殖的影响以5×103/孔接种MGC803细胞于96孔培养板，设3个复孔，实验组加CDDP处理，使终浓度分别达0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L，对照组加生理盐水，共同孵育12、24、48、72h，加20μl的MTT，继续培养4h，弃上清，加150μl的DMSO，酶联免疫检测分析仪测定570nm处的吸光值A570nm，并计算该浓度下的抑制率＝(对照组A570nm-试验组A570nm)／

6、对照组A570nm×100％。1.2.3荧光显微镜检测各组药物对细胞凋亡的作用MGC803细胞加CDDP处理，使终浓度分别达0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，作用12、24、48、72h，设3个复孔,收集细胞离心，弃上清，PBS洗3次，制成细胞悬液，加入终浓度均为100μg/ml的AO、EB，混匀，于显微镜下计数至少200个细胞的凋亡比率。早期凋亡细胞核染色质着绿色，呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞核染色质着桔红色，呈固缩状或破裂状；坏死细胞核染色质着桔红色，呈正常细胞结构；活细胞核染色质着绿色，呈

7、正常细胞结构3。1.2.4流式细胞仪检测各组药物对细胞周期的影响MGC803细胞加CDDP处理，使终浓度达0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，对照组加生理盐水，共同作用48h,常规消化细胞，离心，PBS洗2次，每管加入70％的冰乙醇1～1.5ml，使每个样品含细胞数至少1×106个，－20℃固定送检流式细胞。1.2.5RTPCR法检测CDDP干预前后survivin、bcl2mRNA表达变化总RNA的制备：MGC803细胞接种于6孔板，试验组加CDDP处理，使终浓度达1.0mg/L，对照组加生理

8、盐水，设3个复孔，采用Trizol法提取药物干预前及干预12、24、48、72h细胞总RNA。RNA逆转录：按MMLV说明书进行，cDNA置－20℃保存备用。PCR扩增：反应体系包括10×TaqBuffer5μl，25mM/LMgCl23μl，10mMDNTP1μl，10pmol/μl的目的基因上、下游引物(survivin上游引物:5'CAGATTTGAATCGCG