补肾通络中药对类风湿性关节炎foxp3表达的影响

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1、补肾通络中药对类风湿性关节炎Foxp3表达的影响【摘要】目的：观察补肾通络中药对类风湿性关节炎患者Foxp3表达的影响。方法：随机选择来我院健康体检者30例为对照组，同时选择我院门诊类风湿性关节炎患者50例为治疗组。治疗组患者（初治/或经过两周的清除期）内服补肾通络方3个月后，提取所有受试者外周血总RNA，逆转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR法检测对照组和治疗组治疗前后Foxp3mRNA的含量。结果：治疗组治疗前后外周血Foxp3表达水平均明显低于对照组（P＜0.01），治疗组治疗后外周血Foxp3表达水平亦明显高于治疗前（P

2、＜0.01）。结论：类风湿性关节炎患者存在表达Foxp3的调节性T细胞数量减少和/或功能降低，这种调节性T细胞亚群的异常可能参与了类风湿性关节炎的发病和病变进展，补肾通络中药治疗类风湿性关节炎可能是通过上调Foxp3表达而发挥作用。【关键词】类风湿性关节炎补肾通络中药Foxp3mRNA实时荧光定量PCR法β2m调节免疫功能类风湿性关节炎（RheumatoidArthritis，RA）是一种以慢性破坏性关节炎为主要特征的系统性自身免疫疾病。RA源于免疫平衡失调，机体通过多种机制调控自身免疫应答，其机制十分复杂，调节性T细胞在免疫平衡

3、机制方面起着重要作用，但其在RA发病机制中的作用尚不清楚。本研究对中药治疗RA后外周血调节性T细胞的特异性标志Foxp3进行测定，探讨Foxp3在RA发病中的意义，探讨中药调控T细胞介导RA适应性免疫应答的机制，为RA发病机制及用补肾通络中药防治RA提供理论依据。1资料与方法1.1临床资料随机选取来我院体检的30例健康者作为正常对照组（对照组），同时选择我院门诊50例RA患者作为治疗组。对照组中男12例，女18例；年龄最小15岁，最大57岁，平均（52.19±10.50）岁；治疗组中男18例，女32例；年龄最小13岁，最大61岁，

4、平均（51.21±11.73）岁；病程最短3年，最长15年，平均（7.5±2.6）年。所有RA病例均符合美国风湿病学会1987年的类风湿性关节炎分类诊断标准［1］。1.2治疗方法治疗组（初治/或经过2L。采用淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品有限公司生产）分离外周血单个核细胞，利用Trizol（美国Invitrogen公司生产）一步法提取外周血单个核细胞总RNA，取总RNA2μg进行逆转录反应合成cDNA，-80℃保存。1.3.2　Foxp3定量标准品的构建取上述cDNA2μL，进行PCR扩增。Foxp3引物（上海博亚公司合成）：5

5、′-TCAAGCACTGCCAGGCG-3′和5′-CAGGAGCCCTTGTCGTCGGAT-3′。将PCR产物插入pgM-T载体（北京天为时代公司生产），并转化感受态大肠杆菌TOP10（北京天为时代公司生产），经蓝白斑筛选获得阳性克隆，测序鉴定目的片段插入正确。抽提质粒，并进行1∶10倍比稀释，制成107ng/mL、106ng/mL、105ng/mL、104ng/mL和103ng/mL共5个标准品，分装后-20℃保存。1.3.3　外参照β2m定量标准品的构建　取上述cDNA2μL，进行PCR扩增。β2m引物（上海博亚公司合成）

6、：5′-CCAGCAGCGAATGGAAACTC-3′和5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3′。余步骤同1.3.2。1.3.4　荧光定量PCR法检测Foxp3mRNA相对含量取上述cDNA1μL，使用QuantSYBRgreenPCRkit（美国ABI公司生产）进行PCR扩增，终体积25μL。同时进行各自标准品的扩增，每个样本均重复3复孔。PCR反应条件：50℃2min，95℃10min，扩增40个循环（95℃30秒，52℃30秒，72℃30秒）。为了消除样本提取、逆转录和PCR反应过程中造成的差异，以Foxp3mR

7、NA和β2mmRNA含量的比值，即Foxp3的相对表达水平，作为评价Foxp3表达水平的指标。1.4统计学方法结果采用SPSS10.0进行统计分析，各组间比较采用方差分析。2结果2.1疗效标准参照国家中医药管理局1994年发布的《中医病证诊断标准》类风湿性关节炎的疗效评定标准［2］。痊愈：关节疼痛肿胀消失、晨僵消除；好转：关节疼痛肿胀消失，偶有痛感，晨起稍有僵硬；无效：关节疼痛肿胀、晨僵同治疗前。2.2疗效观察2.1.1补肾通络中药治疗RA的疗效50例RA患者中，痊愈28例，好转15例，无效7例，有效率86.00%。2.2.2补肾

8、通络中药对外周血Foxp3基因表达水平的影响治疗组治疗前Foxp3基因表达水平为（2.11±1.05），治疗后为（4.39±1.78），治疗前后比较有显著性差异（P＜0.01）；对照组Foxp3基因表达水平为（12.62±5.37），与治疗组比较有