胰岛素样生长因子1对脊髓源性神经干细胞定向分化的影响

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1、胰岛素样生长因子1对脊髓源性神经干细胞定向分化的影响【关键词】神经干细胞；脊髓源性；胰岛素样生长因子1；细胞分化脊髓损伤后可导致较高的致残率，但医学上尚未找到较好的治疗方法。脊髓源性神经干细胞的发现为中枢神经系统损伤后的再生治疗提供了新的途径〔1，2〕。作为成体干细胞，这些细胞通常处于静止状态，只有损伤后才表现为增生活跃，但多分化为星形胶质细胞，参与胶质瘢痕的形成，因此神经干细胞定向诱导分化成为当今研究的热点〔3～5〕。有研究表明，胰岛素样生长因子1（IGF1）具有抑制脊髓损伤后神经元凋亡的作用〔6～8

2、〕。为此，本研究拟通过基因转染技术，建立转IGF1基因脊髓源性神经干细胞，研究IGF1对脊髓源性神经干细胞分化的影响，探索治疗脊髓损伤的有效途径。1材料与方法1.1实验材料DMEM/F12(1∶1)培养基，B27添加剂，胎牛血清购自Gibco公司；表皮细胞生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自Sigma公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；新生24h内的EM/F12培养基，从脊柱一端进针充分冲出脊髓组织，不锈钢筛网进行碾压，分离单个细胞。用神经细胞培养液（DMEM/F12为

3、基础培养基，B27添加剂终浓度为1%，bFGF和EGF终浓度均为20ng/ml）调节细胞终浓度为2×105，接种到10cm平皿，37℃、5%CO2培养箱中进行培养。1.2.2转IGF1基因脊髓源性神经干细胞的建立将传代培养细胞接种于6孔培养板中，贴壁细胞达60%～70%时，常规脂质体法进行转染。转染后48h，将细胞消化传代至10cm平皿中，用含G418（600μg/ml）的DF完全培养基进行筛选，含300μg/mlG418的完全培养基维持培养。1.2.3IGF1对神经干细胞的作用将上述脊髓源性神经干细胞及

4、转IGF1基因脊髓源性神经干细胞分别消化传代，接种于6孔培养板中，培养基内去除生长因子（bFGF/EGF/B27），继续培养48h。光学显微镜观察细胞增殖及分化情况。2结果2.1转基因脊髓源性神经干细胞的建立本研究选择了脂质体2000，将重组质粒和脂质体混匀形成复合体，然后转染到细胞中，24h后荧光显微镜下观察转染情况（图1）。2.2转基因与非转基因脊髓源性干细胞的增殖与分化倒置相差显微镜观察转基因前后细胞增殖分化的变化（图2）。由图中可以看出未转染IGF1的神经干细胞在去除生长因子的培养基中难以维持增殖

5、（图2），48h后细胞发生凋亡（图2）；而转IGF1基因神经干细胞可维持克隆样生长（图2），并向神经元细胞方向分化（图2）。新近研究发现，在哺乳动物胚胎乃至成体脊髓内都有干细胞存在。在成年期，这些细胞损伤后才表现为增生活跃，多分化为星形胶质细胞，参与胶质瘢痕的形成。因此如何定向诱导脊髓源性神经干细胞分化成有功能的神经元成为当今的焦点问题。已有的研究结果显示，体外培养过程中，对EGF敏感的干细胞生成神经元非常少，绝大多数是星形胶质细胞；而bFGF能使分化生成的神经元比例增加，但随着培养时间的延长和传代次数的增

6、多神经元比例逐渐下降。本课题组通过研究发现，IGF1可减少急性脊髓损伤后神经细胞的凋亡，并为损伤后神经再生提供内源性基础，是神经干细胞分化过程中的重要调控因素。因此选择IGF1对脊髓源性神经干细胞进行干预，建立转IGF1基因神经干细胞，观察在诱导凋亡和诱导分化过程中，转基因和非转基因细胞凋亡、分化方向的差异。实验结果表明未转染IGF1的神经干细胞在去除生长因子的培养基中难以维持增殖，48h后细胞发生凋亡；而转IGF1基因神经干细胞可不断增殖，并向神经元细胞方向分化。该结果进一步验证了IGF1在脊髓

7、源性神经干细胞诱导分化过程中的作用，为深入研究脊髓损伤的治疗奠定了基础。【参考文献】1KameiN，TanakaN，OishiY,etal.BDNF，NT3，andNGFreleasedfromtransplantedneuralprogenitorcellspromotecorticospinalaxongrocellsandolfactoryensheathingcellsfortherepairofspinalcordinjuries〔J〕.MedHypotheses，2007;69(6):1234

8、7.3闫长祥，安沂华，历俊华.大鼠脊髓源性神经干细胞的培养分化及其特征性研究〔J〕.中华神经外科杂志，2003；19（2）：1357.4KohyamaJ，KojimaT，TakatsukaE,etal.Epigeicregulationofneuralcelldifferentiationplasticityintheadultmammalianbrain〔J〕.ProcNatlAcadSciUS