血小板源性生长因子及胰岛素样生长因子对大鼠腰椎间

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1、血小板源性生长因子及胰岛素样生长因子对大鼠腰椎间【摘要】目的：探讨血小板源性生长因子（PDGFs）及胰岛素样生长因子（IGFs）对大鼠椎间盘退变（IDD）的影响。方法：36只成年健康SD大鼠，随机分为PDGFs实验组、PDGFs加IGFs实验组及阴性对照组3组，通过手术方法建立IDD模型。在术后不同时期对3组分别注射PDGFs、PDGFs加IGFs及生理盐水，于造模后1个月和2个月每组分别处死6只大鼠，完整取出L3～4椎间盘测量蛋白多糖含量，取L4～5椎间盘使用免疫组化法检测Ⅱ型胶原含量，取L5～6椎间盘使用流式细

2、胞仪检测各组大鼠椎间盘细胞的凋亡情况。结果：造模当日和术后1个月开始注射试剂的3组椎间盘蛋白多糖含量、Ⅱ型胶原含量及细胞凋亡率差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论：PDGFs对大鼠IDD有预防和治疗作用，PDGFs与IGFs联用有协同作用。【关键词】椎间盘；退行性变；血小板源性生长因子；胰岛素样生长因子；大鼠椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration，IDD)是下腰痛和腰椎间盘突出症的主要原因［1］，临床上的保守治疗和手术治疗效果均不甚理想［2］。随着生物化学、分子生物学的发展，

3、生长因子与IDD的关系备受国内外学者的关注［3］。血小板源性生长因子（PDGFs）作为一种人体内含量甚微而有多种生物学活性的多肽，对间充质的细胞有较强的促细胞分裂、促基质合成的作用，是体内重要的细胞因子之一。PDGFs具有多种生物学效应，在软骨形成以及代谢调节中起重要作用，有抑制某些有害刺激的凋亡诱导作用［4］。有学者在人退变腰椎间盘组织中用免疫组化方法测得PDGFs的存在[5]；另有学者在PDGFs干预下培养人椎间盘细胞，结果表明一定浓度PDGFs可以减少椎间盘细胞凋亡［6］。胰岛素样生长因子(IGFs)是一种低

4、分子质量多肽,具有胰岛素样作用。其在体外培养条件下具有维持细胞表型、促进细胞外基质合成、抑制凋亡和促进细胞增殖作用［7］。动物实验［89］表明，IGFs具有明显抗凋亡作用，可刺激髓核细胞蛋白聚糖的合成，缩短有丝分裂时间，抑制MMPs的生成增加。以上结果提示，PDGFs及IGFs与IDD关系密切。本研究应用PDGFs及IGFs对大鼠IDD模型进行干预，通过免疫组化法观察Ⅱ型胶原改变、检测椎间盘蛋白多糖含量及流式细胞仪检测细胞凋亡率，探讨PDGFs及IGFs对大鼠腰IDD的影响。1材料和方法1.1动物和试剂3月龄清洁

5、级SpragueDag·kg-1）腹腔注射麻醉，俯卧位，固定四肢，背部备皮，消毒铺单。以L3为中心切除大鼠关节突、棘突及棘上棘间韧带，切断双侧竖棘肌，依层次缝合皮下筋膜、皮肤后放入单独笼中饲养。术后连续3d每只大鼠予青霉素5万U肌肉注射。造模成功后大鼠随机分为6组，每组6只。随机选取其中两组作为PDGFs实验组，分别于造模当日及造模后1个月腹腔注射PDGFs（100ng·kg-1），隔日1次，连续1个月；随机选两组为PDGFs加IGFs实验组，分别于造模当日及造模后1个月腹腔注射PDGFs（100ng·kg-1）

6、及IGFs（100ng·kg-1），隔日1次，连续1个月；另两组为阴性对照组，分别于造模当日及造模后1个月腹腔注射等量生理盐水，注射频次及持续时间同前两组。36只大鼠全部存活，分别于术后1、2个月分批处死各组大鼠，立即取出腰椎，仔细剔除椎间盘周围肌肉，沿L3、L4、L5、L6椎体的上下终板完整取下L3～4、L4～5、L5～6椎间盘。L3～4、L5～6椎间盘标本置于超低温冰箱中分别留待检测蛋白多糖及作流式细胞仪检测用；L4～5椎间盘立即用蒸馏水冲洗3遍后置于10%多聚甲醛溶液中固定。实验过程中各批标本分别集中取材，标

7、本的处理及检测等步骤均严格保持一致。1.3检测方法1.3.1免疫组化技术取10%多聚甲醛溶液固定24h的L4～5椎间盘，常规EDTA脱钙，石蜡包埋，按5μm厚度连续切片5张。将30％H2O21ml加入双蒸水10ml,滴于组织块上，室温下10min以灭活内源性酶；双蒸水洗玻片3次,滴加复合消化液于组织上，保持室温10min后用双蒸水洗玻片3次以修复抗原，滴加5％BSA封闭液，室温20min；将兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体按1∶50稀释(用双蒸水稀释)，放置于冰箱中4℃过夜；滴加生物素化山羊抗兔IgG,保持室温20min

8、；滴加试剂SABC于组织上，并保持室温20min；DAB显色,苏木素复染1min，自来水冲洗,脱水、透明及中性树胶封片。应用计算机图像分析系统及其软件(SimplePCI)评价呈阳性染色的髓核组织基质，自动计算其灰度值。1.3.2蛋白多糖检测将超低温冰箱中保存的L3～L4椎间盘组织取出解冻后置入离心管中，加入3％NaOH0.5ml置于恒温振荡器中振荡3h，温