胰岛素样生长因子I对大鼠脊髓损伤后Bcl2蛋白表达的影响

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1、中国医科大学硕士学位论文胰岛素样生长因子I对大鼠脊髓损伤后Bcl-2蛋白表达的影响姓名：邸春伟申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：常楚20030401中文摘要前言脊髓损伤是目前危害我国人群的一大疾病，在我国乃至世界范围均有很高的致残率。继发性损伤的治疗是脊髓损伤治疗的关键，也是目前的一大难题。胰岛素样生长因子一I(IGF—I)，具有广泛的生物学作用，有实验证明在脑组织的缺血缺氧性损伤中有重要的治疗作用。但对脊髓损伤的治疗研究却罕见报道。笔者应用大鼠脊髓损伤模型，早期局部给予胰岛素样生长因子I，测定48小时后大鼠的后肢

2、运动功能、存活的运动细胞数目及Bcl一2蛋白的表达，观察胰岛素样生长因子对脊髓损伤后脊髓截瘫和神经细胞的影晌。(材料和方法1．动物分组：健康WISTAR大鼠22只，雌雄不限。体重240～一260克，随机分为3组：(1)单纯损伤组：脊髓损伤+生理盐水8只。(2)IGF—I组：脊髓损伤+胰岛素样生长因子8只。(3)胰岛素组：脊髓损伤+胰岛素6只。在损伤后48小时检测大鼠后肢运动功能(Tarlov法)、脊髓前角运动细胞数目及Bet一2蛋白表达情况。2．脊髓损伤模型的建立：应用改良Allen打击法。以10％的水合氯醛腹腔内注射麻

3、醉(2ml／kg)，将大鼠固定于手术台上，腰背部脱毛，消毒，铺巾。以脊柱为中心纵行切开背部皮肤及皮下组织，剥离两侧椎旁肌。暴露T6一髑脊突椎板，咬除卵脊突和椎板显露硬膜，按改良的Al—len打击法将打击头(直径2毫米)放置在硬膜上，并与打击器连接，先使重锤(109)自然下垂，重物高度调整至5厘米，打开扳机，重物自然下落，打击重量为50cm．g。致伤脊髓，分别注入胰岛素(胰岛素组)、胰岛素样生长因子I(胰岛素样生长因子组)。单纯损伤组注入等量等渗盐水。3．病理标本的制备：术后48小时用10％的水合氯醛(2ml／kg)腹腔内

4、注射麻醉，左心室插管后剪开右心耳，先灌注等渗盐水250毫升，再灌注体积分数为4％的多聚甲醛250毫升，然后切取以伤段为中心长约20毫米长的脊髓，多聚甲醛固定，常规石蜡包埋连续切片，片厚6um。随机计数12张切片(损伤段，损伤上段和损伤下段各4张)。4．检测指标及方法：(1)后肢运动功能评估：应用改良的Tarlov分级法：0级：无运动；1级：轻微运动；2级：扶持能坐；3级：能坐；4级：微跳；5级：正常。(2)脊髓运动细胞数目计数：每一标本所得的12张切片中的6张(损伤上段、损伤中段、损伤下段各2张)经HE染色，计数每张切片

5、中的脊髓前角运动细胞数目，取其平均值。(3)Bel一2蛋白的检测：免疫组化SP法。Bcl一2单克隆抗体(购自博士德公司)，参照sP试剂盒说明书进行操作。镜下记录阳性细胞数。5．统计方法：应用SPSS11．0统计软件进行数据处理。用MannWitneyUTest进行Tarlov评分的检验。用方差分析比较运动细胞数目和Bcl一2阳性细胞(P<0．05)。·2·结果1．大鼠后肢运动功能评估：单纯损伤组中有4只在术后6小时即发生截瘫，另外4只在术后24刭48小时进展至截瘫。而IGF—I组的大鼠在术后48小时仍然保持后肢运动功能在

6、4—5级。尽管胰岛素组中有2只大鼠的后肢运动功能保持在4—5级，但其他4只在术后24—48小时进展至截瘫。2．脊髓灰质前角运动神经细胞数目：组织学检查见单纯损伤组脊髓损伤明显，镜下表现为脊髓前角运动细胞数目减少，Nissl小体消失、运动神经细胞核溶解以及脊髓灰质中有空泡形成。相反IGF—I组的镜下未见上述表现。细胞形态良好，无明显空泡形成。尽管胰岛素组的运动细胞数目未见明显减少，但具有与单纯损伤组类似的脊髓损伤的镜下表现。运动细胞数目的统计结果表明IGF—I组与单纯损伤组比较有明显的统计学意义(P<0．05)。3．Bcl

7、一2蛋白阳性细胞数目：手术后各组均见Bcl～2表达，但对照组和胰岛素组的表达(分别为19．204-2．29和22．32±6．77)显著低于IGF—I组(32．31±4．06)，(P<0．05)。研究表明，术后48小时IGF—I显著增加了Bcl-2蛋白的表达，虽然胰岛素组的运动细胞数目与IGF组相比并不减少，但Bcl一2阳性细胞数目却明显低于IGF组。讨论脊髓损伤是一种具有很高致残率的严重疾病，其损伤机理很复杂，但神经轴索不能再生是脊髓损伤后功能永久丧失的主要原·3·因，为给脊髓轴突的再生创造有利的环境，各国学者进行了多方

8、面研究，采用的方法主要集中在以下几个方面：(1)生长抑制因子抗体；(2)电刺激；(3)外周神经移植；(4)雪旺细胞移植；(5)胚胎组织移植；(6)嗅鞘胶质细胞移植；(7)神经营养因子。IGF—I是由70个氨基酸残基组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌的单链多肽，在体内的表达受到生长激素的调节。IGF—I生物学作用广泛，不