renin过表达对动脉粥样硬化炎症影响的实验研究

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1、Renin过表达对动脉粥样硬化炎症影响的实验研究杨亚培1,2#*徐慧3董秋立4（1山东大学附属省立医院心内科250021;2聊城市人民医院中心实验室252000；3山东省警官总医院心内科；4河北省任丘市华北石油管理局总医院心内科）【摘要】肾素-血管紧张素系统（RAS）由一系列酶、激素及其受体组成，在动脉粥样硬化（AS）发生发展过程中起重要作用。肾素（Renin）可特异性催化血管紧张素原转化为血管紧张素I,后者再转化为血管紧张素II（All）,从而激活RAS。RAS的激活可导致血管内皮功能减退，炎症反应加剧，AS斑块不稳定，促进AS病变的演进发展

2、。Renin作为All上游的RAS成员，在心脑血管遗传学研宄中越来越受到重视，因此木实验在前期构建了人Renin基因腺相关病毒表达载体的基础上，通过体外细胞实验，进一步探究Renin基因高表达对AS中RAS系统及相关炎症因子表达的影响，为AS的治疗提供新的靶标和思路。【关键词】动脉粥样硬化（AS）;肾素-血管紧张素系统（RAS）;肾素（Renin）;单核细胞趋化因子（MCP）-l【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-7165（2015）09-0482-021材料与方法1.1材料辣根过氧化物酶标记二抗系武汉博丄•德生物公司产品;&

3、beta;-actin单克隆抗体系美国SantaCruz公司产品;预染蛋白marker购于晶美生物有限公司。兔抗人VIII因子单克隆抗体、免疫荧光组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2方法1.2.1人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的原代培养及免疫荧光法鉴定HUVECs,经传代并鉴定后的HUVECs,取生长良好的3-8代用于实验。1.2.2细胞转染实验⑴HUVECs用ECM全培养基（含5%胎牛血清+1%内皮细胞生长因子+青霉素100U/ml+链霉素100mg/ml）传代培养。按3×105/孔的密度于转染前一天接种于6孔板，

4、用不含抗生素的ECM培养基（含5%胎牛血清+1%内皮细胞生长因子）继续培养至90-95%融合时进行转染。设PBS空白对照组、rAAV2-RFP空载体转染组和重组rAAV2-Ren-RFP转染组三组。(2)ECM基础培养基将细胞洗两遍后，按MOI值(v.g./cell)5×105计算加入rAAV2-Ren-RFP或「AAV2-RFP的病毒体积数，于Ep管中将需加入的rAAV2-Ren-RFP或「AAV2-RFP与ECM基础培养基混合。(3)将上述rAAV2-Ren-RFP或「AAV2-RFP与ECM基础培养基混合液分别加入每孔细胞中，

5、每孔细胞加200ul，双孔复孔。置于培养箱中培养，lh后吸弃每孔液体，加入lml/孔含5%FBS和1%内皮细胞生长因子的ECM培养基，同时加入10-50mmol/l的丁酸钠以增强其表达。(4)分别于病毒感染24、48及72h,于荧光显微镜下观察荧光强度，选定荧光强度强且细胞状态良好的条件进行后续实验。⑸依上述最佳条件收获细胞，Westernblot检测细胞中Renin和炎症相关蛋白表达情况1.3统计学分析实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS20.0软件进行配对t检验统计学分析，P<0.05为差异具有统计

6、学意义。2结果2.1HUVECS的培养及鉴定倒置相差显微镜下连续观察，原代培养HUVECs于4h后出现贴壁生长，形态开始时呈圆形，之后逐渐呈梭形或多角形生长，细胞边界清晰，胞浆丰富，核内染色质清亮稀疏，可见1-2个核仁。细胞单层生长，镜下呈典型“铺路石”样特征(图1)。经VIII因子相关抗原特异性令克隆抗体的免疫荧光染色法，检测HUVECsVIll因子抗原为阳性。2.2转染最适条件的确定由于构建的重组rAAV2-Ren-RFP带奋RFP标签，以此为依据分别于病毒转染24h、48h和72h在荧光显微镜下监测显示，转染HUVECs48h后荧光亮度最

7、强(图2)。3讨论AS是由多种致病因素共同作用于血管壁而引起的慢性炎症性疾病,是冠心病和脑梗死共同的病理基础，血脂代谢异常、内皮细胞损伤以及炎症等均是AS发生发展的重要因素，其中炎症在AS发生演进中占有重要地位［1,2］。AS不稳定性斑块的形成与脂质代谢障碍、血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞异常增殖、巨噬细胞内皮下浸润等多种因素有关。血管内皮细胞损伤和功能减退是AS发生、发展的关键步骤之一、［3］。血管内皮细胞损伤后可表达ICAM-1、PAI-1等活性物质。粘附分子能介导淋巴细胞和单核细胞与内皮细胞的粘附，并介导它们穿过内皮细胞进入血管壁，促进

8、AS的形成。血管内皮细胞功能减退，可能诱导申核细胞和淋巴细胞等白细胞向血管炎症部位游走、粘附、聚集并穿越血管壁,促进AS的形成和发展［4-6］。Ren