重组腺相关病毒介导的人凝血因子ix基因在人-鼠结肠癌上皮细胞中

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1、重组腺相关病毒介导的人凝血因子IX基因在人/鼠结肠癌上皮细胞中马泳泳，陈方平，杜建伟，陈焱，彭建强，吴小兵，解勤之【摘要】目的:探讨重组腺相关病毒/人凝血因子IX基因（rAAV-2/hFIX）在人/鼠结肠癌上皮细胞(Sethods:rAAV-2/GFPan/ratgutepithelialcells,theexpressionofGFPeasured.rAAV-2/hFIXan/ratgutepithelialcells.TheexpressionsofhFIXetersofDNA,proteinandbiolo

2、gicalactivity.Results:（57.0±8.5）%SAN公司产品；DYY-6B型稳压稳流电泳仪为北京六一仪器厂产品；紫外透射仪、天能GIS凝胶图像处理系统GIS3.03为上海天能科技有限公司产品；TGL-16G型台式离心机为上海医用分析仪器厂产品；DYADTMDNAEnginePCR仪为美国MJResearch公司产品；ELISA仪为ELx800BIO-TEKInstruments.Inc产品。1.2病毒和细胞株病毒rAAV-2/GFP和rAAV-2/hFIX由病毒基因工程国家重点实验室吴小兵教授

3、惠赠。rAAV-2/GFP，滴度为5×1011v.g/ml,纯度大于98%。rAAV-2/hFIX，滴度为1×1012v.g/ml，纯度大于98%。pSNAV1GFP/FIX载体质粒由GFP/FIXcDNA正向插入通用型AAV载体质粒pSNAV1的克隆位点构建而成，rAAV-2/GFP病毒的包装、纯化、滴度及纯度的测定按文献[2-4]方法进行。人结肠癌细胞株SEM培养液、37℃5%CO2饱和湿度的培养箱中常规传代培养。1.4rAAV-2/GFP体外转导SEM培养基（含10%PBS），37℃5%CO2饱和湿度培养约

4、12h。待SEM培养基洗涤3次。计数细胞，用rAAV-2/GFP感染24孔板中生长的SOI1×105v.g/cell，在不含PBS的DMEM培养基200μl内培养，37℃5%CO2饱和湿度培养约2h。弃去上清液，DMEM培养基洗涤3次。加入DMEM培养基（含10%PBS）1ml，37℃5%CO2培养。14～48h后，在倒置荧光显微镜下观察GFP在细胞中的表达，发出绿色荧光的即为GFP阳性细胞。2～3d传代一次，弃去培养液，PBS液洗涤3次，加入0.25%胰蛋白酶150μl/孔，37℃作用5min左右，倒置显微镜下

5、观察到细胞间隙增大即中止消化，以1:3比例传代。分别于转导后2d、7d计数200个细胞在荧光显微镜下绿色荧光的百分率，即转染率。1.5rAAV-2/hFIX体外转导SEM培养基中培养，24h后，用不含血清的DMEM培养液洗涤3次，细胞计数，加入rAAV-2/hFIX，MOI1×105v.g/cell，设3个复孔。同时设阴性对照。培养约2h后洗涤2次，换成含10%PBSDMEM培养液，分别在2d、7d、14d和21d取5×105细胞，洗涤2次后重悬于无血清培养基中，种植于24孔板，1ml/孔，加入维生素K14μg/

6、ml，24h后收集上清液，同上做各项检测。1.6细胞总DNA的提取按常规方法提取DNA后鉴定DNA的质量，测定DNA的浓度和纯度。1.7PCR法检测rAAV-2/hFIX转导的细胞中hFIX基因的表达hFIX上游引物:5′-CTTGATCATGAAAACGCCAA-3′，下游引物：5′-AACATACTGCTTCCAAAATT-3′，产物长度183bp或371bp；G3PDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，产物长度43

7、9bp。反应总体积为25μl体系：DNA模板2μg，10×Buffer2.5μl，10mmol/LdNTPs0.5μl，TaqDNA聚合酶（2u/μl）0.5μl，hFIX上游引物和下游引物（10pmol/μl）各1.5μl，灭菌去离子水加至25μl。反应条件：95℃预变性8min，90℃变性30s，52℃退火30s，65℃延伸2min，重复30个循环后65℃延伸10min。PCR产物4℃保存。扩增内参基因时，用G3PDH引物替代hFIX引物，其余条件一致。1.8酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养细胞上清液中h

8、FIX抗原的含量按试剂盒提供的方法进行。在波长492nm处测定各孔OD（opticaldensity，光密度）值。以OD值对hFIX标准血浆含量%作半对数标准曲线，求出回归方程，以正常人标准血浆IX因子蛋白浓度为5000ng·ml-1，计算各测定样本hFIX蛋白浓度。1.9一期法检测培养细胞上清液中hFIX的活性APTT时间参照王振义等[5]报告的方法测定。以标准血浆稀释