bac-to-bac杆状病毒昆虫表达系统介导重组腺相关病毒的制备

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1、河南大学硕士学位论文Bac--to--Bac杆状病毒昆虫表达系统介导重组腺相关病毒的制备姓名：陈雅宁申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：韩双印201204摘要目的：通过杆状病毒昆虫表达系统，实现临床级重组腺相关病毒(rAAV)的制各。方法：将腺相关病毒(AAV)载体pAAV-MCS的两端反向重复序列(ITR)及目的基因表达框用限制性内切酶Pcil和SfoI双酶切，得到大小约2053bp的目的片段，过胶纯化回收后用Klenow平端化处理。杆状病毒载体pFastBacDuai用限制性内切酶KpnI和HindlII双酶切，过胶纯化回收得到4806bp的日的片段，通过Klenow

2、和T4Polymerase平端化处理，用SolutionI连接酶将两个片段连接到一起，构建成6859bp大小的顺式载体。经NdeI和HpaI双酶切和EcoRl单酶切鉴定，及DNA测序无误后命名为pBclAAV-MCS；为了检测两杆状病毒昆虫表达系统的可行性，设计正向引物EGFP．EcoRI．F和反向引物EGFP．Xbai．R经PCR反应从plRES．EGFP巾扩增得到大小约720bp的EGFP基因片段，因为pBclAAV-MCS有同样的酶切位点EcoRl和Xbal，用SolutionI连接酶将EGFP基因片段插入到pBclAAVMCS的EcoRl和Xbal位点，经DNA测序正

3、确后命名为pBclAAV-EGFP。反式载体足利用真核细胞基因表达调控的遗漏扫描(1eakyscanning)原理，在几个翻泽起始部位引入ACG或CTG，这样一个启动子可以同时启动表达多个片段，将pAAV-MCS的衣壳蛋白(Capl)和复制蛋白(Rep2)经PCR反应分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBacDual的启动子PPlo和PPH下，命名为pBclAAVCap／Rep。分别将顺式载体和反式载体转化到DHloBacm感受态中，制备成重组杆状病毒颗粒Bacmid，经PCR鉴定正确后，分别命名为BacmidAAV-EGFP和Bacmid腓Cap／Rep。按照lnvitro

4、gen质粒提取步骤提取BacmidDNA后分别用转染试剂脂质体CellfectinlI包装，转染sf9细胞制备Pl病毒，然后用P1扩增P2病毒，使病毒滴度达到约l012v．g．／ml，用BacmidAAV-EGFP和BacmidAAV-Cap／Rep的P2病毒共感染昆虫细胞sf9完成rAAV的拯救和包装过程。最后rAAV感染293T细胞来检测其活性。结果：顺式载体由pAAV-MCS和pFastBacDual剪接嵌合而成，大小为6859bp，酶切鉴定及测序正确，命名为pBclAAV-MCS，将EGFP引入其多克隆位点，来检测该系统的可行性，测序正确后命名为pBclAAV-EGF

5、P；反式载体是利用真核基因遗漏扫捕原理表达AAV的包装元件，其中衣壳蛋白是南同一mRNA、不同起始密码子和共I一的终-I卜子转录生产，复制蛋白包含Rep78和Rep52，起始密码子分别是AUG和CUG，将衣壳蛋白和复制蛋白这两个基因表达片段经PCR反应连接到相应的限制性内切酶位点，分别克隆到杆状病毒载体pFastBacDual的启动子PPlo下的KpnI和XhoI位点和PPH下的HindlIl和BamHI位点，经DNA测序正确后命名为pBclAAVCap／Rep。此后将顺式载体和反式载体分别再转化到DHl0BacTM感受态细胞中，转座形成杆粒Bacmid、在悬浮培养的昆虫sf

6、9细胞中制备成杆状病毒，病毒滴度可达1-3x1012v．g．／ml。然后用二杆状病毒共感染sf9细胞，完成rAAV-EGFP的拯救、复制和包装过程，经感染293T细胞测试具有良好的生物学活性。结论：该系统克服了常规rAAV制备的限制性冈素，为临床级基因治疗用病毒的制备提供了实验依据，为rAAV的基因治疗打下了良好的基础。n关键词：杆状病毒昆虫表达系统，sf9细胞，腺相关病毒，293T细胞ABSTRACTObjective：Tomakeanefficientandsafemethodforproductionofrecombinantadeno。associatedvirus(

7、rAAV)ofclinicalscalebybacuiovirusinsectexpressionsystem．Methods：Invertedterminalrepeat(ITR)andtargetgeneexpressionflameofrecombinantadeno—associatedvirus(rAAV)vectorpAAV-MCSweredigestedbyrestrictionendonucleasePciIandSfol，gettingthe2053bpoftargetfragment