重组腺相关病毒介导的rna干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

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1、分类号：单位代码：10092密级：学号：20101053重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎单病毒复制和表达的影响河北北方学院基础医学院专业：病理学与病理生理学研究生姓名：付冰峰导师姓名及职称：宁守斌教授、张晓云教授研究起止日期：提交日期：2012．4—2013．42013．5河北北方学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河：it：It方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：．、“咱叫、、，研究

2、生签钏寸“<啐年月日研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师虢咱鸣鼍．研究生签名：1寸hj<霹1年月日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表

3、达的影响前—言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯66日IJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35综述RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯．．39致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．48个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49目录中文摘要重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响摘要乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HSV)感染是一个非常严重的全球性的公共卫生问题，全世界约3．5亿人为慢性HBV感染者，每年全球大约有100万人死于与HBV感

5、染相关的疾病，包括肝炎(Hepatitis)、肝硬化(Cirrhosis)、肝衰竭(Hepaticfailure)和肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)。目前对HBV感染的主要治疗手段包括干扰素、核苷及核苷酸类似物等，但是这些药物只能在少数慢性感染患者中能产生长期应答，并不能彻底清除乙肝病毒，并且也存在着治疗后复发率高、药物毒副作用较大和药品价格昂贵等问题，因此，必须寻找更有效的治疗手段。RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)R0将与其目的基因同源的小分子双链(dsRNA)导入

6、细胞内，导致目的mRNA降解，从而阻断真核细胞中相应基因产物的表达，它具有抑制效率高、特异性强、细胞较容易摄取等优点，成为-,0e新的分子生物学技术。但同时也存在作用时间短暂等不足。为解决这一问题，本实验采用腺相关病毒作为载体，利用它具有高稳定性、高靶向性、低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛、可长期表达等优点，作为抗HBV的shRNA表达框的载体，转染含HBV病毒全基因组的HepG2．2．15细胞，观察对HBV复制和表达的抑制作用，尝试解决RNAi技术抗HBV作用时问短暂的问题。本研究将hu6驱动的shRNA表达框置于腺相关病

7、毒(Adeno—associatedvirus，AAV)的两个ITR(Invertedterminalrepeat，ITR)之间，之后接有HBV的基本核心启动子(BacicCorepromoter，BCPl及其驱动AAV的Rep基因，由此构成rAAV，作为抗HBV的shRNA表达框的质粒载体，转染HepG2．2．15细胞(乙肝病毒基因插入肝细胞性肝癌细胞中)，测定转染后细胞上清液中第1天、第2天、第3天及中文摘要第10天HBsAg、HBeAg表达及HBVDNA拷贝数，并对细胞基因组AAVSl区域进行测序。经检测表明，成功构建了

8、含目的序列的rAAV质粒载体PLRBR322—324、PLRBR522—324、PLRBR322—2424、PLRBR522—2424。体外质粒转染细胞实验显示四个载体对HBsAg、HBeAg表达及HBVDNA复制都有抑制效应，且前两者对HBsAg更高、后两者对HBeAg更高