Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

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1、Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFast

2、Bac表达结构后可以产生重组杆粒。*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体

3、都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。Vector特点参考pFastBacTM1高水平表达的强AcMNPV聚乙烯（PH）启动子用于简单克隆的大量克隆位点Anderon1996pFastBacTMHT高水平表达的聚乙烯启动子；N-末端含有6XHis，可以用来纯化重组蛋白，并可用TEV蛋白酶切去；提供3个阅读框Polayes1996pFastBacTMDual两个强启动子（PH和p10）可以同时表达两种蛋白；两个大的克隆位点Harris和Polaye1997指南用途：指南提供了

4、一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBacTM供体质粒的选择2、转化pFastBacTM结构到最高效的DH10BacTM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplifyandtiter）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这

5、系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。Bac-to-Bac表达系统表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBacTM菌株。基于pFastBacTM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV

6、40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7*第二个主要结构是Ecoli的DH10BacTM品系，用来作为pFastBacTM菌株的宿主。DH10BacTM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBacTM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBacTM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆

7、虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10BacEcoli中包括：*一个低拷贝的微型F复制子*卡那霉素的抗性标记*一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒EcoliDH10Bac中扩增，在显色

8、物质如Bluo-gal或X-gal和诱导剂IPTG存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10BacEcoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7转化功能。图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达实验轮廓：流程：下图揭示了表达目的基因的一般步骤1、pFastBacdonor质粒（步骤：目的基因的克隆）得到