重组人infα2bigg4 fe融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达

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1、新乡医学院硕士学位论文重组人INFα2b/igG4Fe融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达姓名：姬朝霞申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：韩双印201204新乡医学院硕士学位论文重组人IFN0c2b／IgG4Fc融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达摘要背景和目的慢性乙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病，全球目前约有3．5亿慢性乙型肝炎病毒感染者；慢性丙型病毒性肝炎亦影响着全球近1．8亿人，该病的危险性主要在于其高慢性化率和可能发生的严重并发症，包括肝硬化和肝癌。病毒性肝炎的防治是一个全球性公共卫生问题，已引起世界各国的关注。干扰素(interfemn，IFN)是目前公认的有效抗

2、病毒药物，迄今在临床上已经使用了20多年。然而，作为一个小分子蛋白，干扰素从血浆中清除的速度较快，其清除相半衰期为注射后的3～8h，．24h后在血浆中就已检测不到其存在，导致在临床治疗中需要重复多次给药才能达到治疗效果，造成临床应用中的一些不利【11。因此延长IFN仅的半衰期，降低其副作用对IFN0c的临床应用具有重要意义。目前延长干扰素半衰期的方法主要有聚乙二醇(PEG)修饰法、融合蛋白法。近年来，人们关注抗体IgGFc段与干扰素融合蛋白(I帆)的生物学活性和药理作用。这两种干扰素融合蛋白的研制受到国内外学者的广泛关注，作为一种新的基因工程药物在表达系统建立和蛋白质纯化等方面进行了前

3、沿性研究。本课题基于近几年蛋白质表达系统的研究进展，通过分子克隆技术和蛋白质工程技术，依据IgGFc及IFN的特点，利用Bac．to．Bac杆状病毒昆虫表达系统，表达长效IFN／Fc融合蛋白，探索其基本生物学活性，期望提高干扰素的抗病毒治疗效果，为长效干扰素的抗病毒治疗探索新方法。方法1．利用分子克隆技术获得人IFN仅2b及IgG4Fc基因片段，构建杆状病毒穿梭载体pFastBacl一IFMc2．转化DHl0Bac感受态菌株，获得重组杆粒Bacmid．IFN／Fc3．运用脂质体转染技术，将重组杆粒Bacmid．IFN／Fc转染至昆虫细胞Hi曲five，新乡医学院硕士学位论文获得重组杆状

4、病毒4．采用Wrestem．Blot和EuSA检测目的蛋白的表达5．运用细胞病变抑制法测定融合蛋白体外抗病毒活性结果1．经PCR扩增、限制性内切酶酶切及核苷酸序列测定，证实获得IfN0【2b及IgG4Fc基因片段，且正确克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBacl中2．在DHlOBac菌株中筛选出含目的基因的重组杆粒3．重组杆粒转染HighFive细胞后出现病理变化，表明转染成功并获得重组杆状病毒4．EUSA证实兔抗人IF№抗体能够识别重组IFN／Fc融合蛋白5．Wrest锄．B10t鉴定IFN／Fc融合蛋白显示，在45kD处有特异性的蛋白条带6．用细胞病变抑制法测定mWFc融合蛋白生物学

5、活性为580砌／ml结论利用杆状病毒昆虫系统成功地表达重组人IF岍c融合蛋白，为新型长效干扰素研制及慢性病毒性肝炎治疗提供实验依据。关键词干扰素；融合蛋白；Bac．to．Bac杆状病毒昆虫表达系统；病毒性肝炎；生物学活性2新乡医学院硕士学位论文ExpressionofRecoII】【binantHumanIFN0c2b／IgG4FcFusionProteininBaculoVirusInsectSystemBackgroudandObjectiVeAbstractChronichepatitisBisacommondiseaseofaserioushazardtohumanhealth

6、andabout350millionpeopleinfectchmnichepatitisBVimsworldwide．灿s0，therearearound180millionpeoplesufferingcllronichepatitisC．T1leriskofthesediseasesmainlyisitshigllchronidtyrateandpossiblyseriouscomplications，indudinghepaticci玎hosisalIdcanceLSo，preVentionaIldtreatmentofViralhepatitisisa酉obalpublich

7、ealthproblemaIldithasattractedtheattentionoftheworld．Interferon(IFN)iswidelyrecogIlizedasaneffectiVeantiViralmedicine，andsofarhasbeenusedinclinicforoVer20years．HoweVer，asasmaUmoleculeprotein，interfemnisclearedfastf曲mplasma，t