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1、8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达PILIZ!脚Ⅵ.pibb.ac.crlResearchPapers墨盈8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达米曹佐武李观贵¨梁郁强"何冬梅f-)甓南人学生命科技学院,广卅I510632;暨南大学血液病研究所,广卅1510632)摘要8型AAV重组病毒载体是新型的基因转移载体,能高效转染肌肉细胞和肝细胞.AAV转染细胞的效果与注射病毒的途径有很大关系.与门脉注射和肌肉注射相比,经腹腔注射的rAAV8病毒能经血液循环转运到全身其他组织器官,形成更加广泛和持久的基
2、因转导.通过腹腔途径把5x10togc的8型重组病毒载体注射到小鼠体内,2周后,小鼠血浆中有明显的基因表达,1个月至2个月期间多数小鼠表达量达到高峰,然后表达水平下降,直到4个月后血浆中尚维持明显的表达量.凝血实验显示,表达的人凝血因子Ⅸ具有生物活性.免疫组化实验显示,病毒载体已进入体内多组织器官巾表达.说明8型AAV病毒载体经腹腔注射后已经血液循环运送到其他组织,并存肌肉,肝脏,肾脏和心脏等器官明显表达,表达产物具有凝血活性.关键词腺相关病毒,腹腔注射,凝血因子学科分类号R394.8腺相关病毒(aden
3、o.associatedvirus,AAV)是单链DNA微小病毒,是一种复制缺陷性病毒.它的复制需要辅助病毒如腺病毒的协助AAV病毒仅由三个核外壳蛋白和一条DNA单链构成,不含酶,酯类及碳水化合物AAV基因组的两端为145个碱基的倒转末端重复序~(ITR),其间是2个开放性阅读框,分别编码与AAv复制相关的Rep蛋白和病毒外壳蛋白Cap蛋白.重组腺相关病毒(rAAV)去掉了野生型AAv自身的基因,仅留下其基因组两端的反向重复序列ITR,其间插入需要表达的目的基因.AAV病毒具有安全性高,免疫原性低,物理性
4、质稳定,感染细胞谱广等优点.此外,AAV病毒能够感染多种宿主细胞,包括分裂期细胞和非分裂期细胞,插入突变的危险性低,对宿主固有的免疫系统影响小,不会引起严重的急性炎症反应.因此被认为是最有前途的基因治疗载体之一.根据病毒壳体蛋白的不同,现已经确定了不同的AAV血清型.不同血清型AAV因外壳蛋白不同在细胞表面存在不同的受体,决定它们对细胞不同的亲嗜性和转导效率.AAV2是研究得最清楚的AAV病毒.rAAV2病毒对神经组织和肌肉组织的感染效率相对较高,而对于其他组织细胞的感染效率相对较低这限制了它在基因治疗中
5、的应用.8型AAV是从灵长类动物新分离出的腺相关病毒血清型…8型重组AAV病毒(rAAV8)载体能更有效地转染肌肉和肝脏等组织器官,而且实验显示,经腹腔注射能经血液循环转运到其他组织器官[.人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)是肝脏合成的,前体蛋白是461个氨基酸的单链血浆酶原,其基因位于X染色体远端,1.383kb的编码区编码4l5个氨基酸的肽链.凝血因子Ⅸ通过水解激活后形成FIXa.凝血因子Ⅸ的表达缺陷导致凝血障碍,临床上表现为乙型血友病,这是一个利用AAv病毒广泛进行基因治疗研究的疾病_3】.乙型血友病基因治疗的
6、靶细胞多为肌细胞和肝细胞等.AAV病毒载体的注射途径有多种,如肌肉注射,门脉注射和静脉注射等.由于凝血因子主要在肝脏表达,因此,肝门静脉注射曾是一个首选的方法,这样病毒能较集中地感染国家自然科学基金部分资助项日(30271370).通讯联系人.Tel:020—31545871,E—mail:caozuowll【@yahoo.com.ca收稿日期:2006—06—13,接受日期:2006—08—31曹佐武等:8型AAV重组病毒介导的凝血因子的基因表达?81?肝脏细胞.然而,实验显示,AAV8重组病毒载体导入
7、肝细胞后,载体DNA降解快『2].肌肉注射简单易行,肌细胞表达的凝血因子也具有凝血活性.但是,肌肉注射的病毒感染细胞范围比较局限,而且往往需要两点或多点注射以增加病毒感染范围.腹腔注射简便易行,经腹腔注射的rAAV8病毒能经血液循环转运到全身其他组织器官,并能在多种组织器官广泛而持久地表达绿色荧光蛋白[21.然而,作为一种较新型的血清型病毒,是否能够通过腹腔注射rAAV8进行凝血因子基因的治疗性研究尚不确定.本文通过腹腔注射8型AAV病毒载体,探讨rAAV8病毒介导的凝血因子Ⅸ在体内表达效果.1材料和方法
8、1.1重组质粒的体外表达功能鉴定8型AAV辅助质粒由美国Wilson教授实验室构建.人凝血因子IX(hFIX)的表达载体pCAhF9由美国Welsh博士赠送,它是一个约7.2kb的质粒.其间有凝血因子Ⅸ的cDNA和剪接的第一内含子.该基因的上游有一个CMV增强子和CBA启动子,下游有牛生长激素的polyA序列.两侧翼各有一个145bp的ITR序歹0.人胚胎肾细胞(HEK293细胞)经胰蛋白酶消化后接入6孔板,在细胞密度达60%
