重组狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究

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1、重组狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究作者：孙海英，程海，李振宇，杜冰，曾令宇，鹿群先，何徐彭，潘秀英，徐开林【摘要】本研究的目的是制备携带狗凝血因子Ⅷ基因的慢病毒载体，探讨慢病毒载体能否介导cFⅧ在体外的有效表达。用构建携带cFⅧ基因的慢病毒载体pTK161和pTK162，同时构建含绿色荧光蛋白的慢病毒载体pTK161′和pTK162′的方法，分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSVG共转染293T包装细胞，将包装好的病毒颗粒再感染293T细胞，检测病毒滴度和培养细胞上清中cFⅧ活性。结果显示：经限制性酶切鉴定，成功构建了pTK161、pTK16

2、2、pTK161′和pTK162′正向连接载体；pTK161′和pTK162′的病毒滴度分别为×10U/ml和×10U/ml；pTK161、pTK162感染靶细胞后24小时细胞上清中即可检测到cFⅧ的表达，72小时表达量达高峰。pTK162载体cFⅧ表达活性接近正常狗血浆FⅧ活性，而且明显高于pTK161(p【关键词】慢病毒ExpressionofRecombinatedCanineFactorⅧInVitroMediatedbyLentiviralVectorAbstractThestudywaspurposedtopreparetherecombina

3、ntlentiviralvectorpTK161andpTK16carryingBdomaindeletedcaninefactor(BDDcFⅧ)gene,andtoinvestigatewhetherthecanineFⅧ(cⅧ)canbeexpressedinvitro.TheBDDcFⅧgenewasligatedbehindPUBandOH1promotorstocreatelentiviralvectorspTK161andpTK162.MeantimelentiviralvectorspTK161′andpTK162′wereproduc

4、edbycloningagreenfluorescentprotEin(GFP)intopTK151andpTK152,whichwasdrivenbyPUBandOH1promotorsrespectively.Vectorsupernatantwerepreparedbyusingtransfercalciumphosphatemediatedcotransfectionof93Tcells.Thevirusvector,ΔNRFpackagingplasmid,andVSVGenvelopeplasmidwasassayedbytitersa

5、ndcFⅧactivityincellculturesupernatantafterinfectioninto93Tcells.pTK161,pTK162,pTK161′andpTK162′wereidentifiedbyrestrictionenzymeanalyzing.TheresultsshowedthatthelentiviralvectorspTK161,pTK162,pTK161′andpTK162′weresuccessfullyconstructed,andthetitersofpTK161′andpTK162′reachedto×10U

6、/ml×10U/ml;theactivityofcFⅧcouldbedetectedathoursafterinfectionof93TcellsbypTK161andpTK162,andachievedthehighestlevelathourslater.ThehigherlevelofcFⅧactivitywasachievedbytransfectedwithpTK16thanthatofpTK161(pKeywordslentiviralvector；caninefactorⅧ；hemophiliaA；genetherapy血友病A是凝血因子Ⅷ基

7、因缺陷导致凝血因子Ⅷ缺乏的X隐性连锁的出血性疾病。目前该病的治疗方法主要是输注血浆源性FⅧ制品或基因重组FⅧ产品，这种蛋白替代疗法疗效肯定，但存在费用昂贵、血源性病毒感染、反复输注会产生抑制性抗体等许多棘手的问题［1-3］。由于血友病A是一种单基因遗传病，基因治疗可望成为一种有效治疗手段［4］。本研究分别构建了含有PUB启动子和2OH1启动子cFⅧ的慢病毒表达载体pTK161和pTK162，采用三质粒包装系统，检测感染细胞上清中的cFⅧ活性，为血友病A慢病毒载体介导基因治疗寻求有价值的实验依据。主要试剂各种工具酶、1kbDNALadder、质粒小量提取试剂

8、盒WizardTMPlusSVMiniprepsDNAPurifi