重组狗凝血因子ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究

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1、重组狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究作者：孙海英，程海，李振宇，杜冰，曾令宇，鹿群先，何徐彭，潘秀英，徐开林【摘要】本研究的目的是制备携带狗凝血因子Ⅷ（cFⅧ）基因的慢病毒载体，探讨慢病毒载体能否介导cFⅧ在体外的有效表达。用构建携带cFⅧ基因的慢病毒载体pTK161（含PUB启动子）和pTK162（含2OH1启动子），同时构建含绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pTK161′（含PUB启动子）和pTK162′（含2OH1启动子）的方法，分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSVG共转染293T包装细胞，将包装好的病毒颗粒再感染293T细胞，检测病毒滴度和培养细胞上清中cFⅧ活性。结

2、果显示：经限制性酶切鉴定，成功构建了pTK161、pTK162、pTK161′和pTK162′正向连接载体；pTK161′和pTK162′的病毒滴度分别为1.54×106U/ml和2.83×106U/ml；pTK161、pTK162感染靶细胞后24小时细胞上清中即可检测到cFⅧ的表达，72小时表达量达高峰。pTK162载体cFⅧ表达活性接近正常狗血浆FⅧ活性，而且明显高于pTK161(p<0.05)，6周后cFⅧ表达活性仍达最高值的1/4。结论：构建的自身失活慢病毒载体可携带较大片段的cFⅧ基因，并在体外可获得有效表达；本研究为慢病毒载体介导的血友病A的基因治疗研究提供实验依据。【关键

3、词】慢病毒ExpressionofRebinatedCanineFactorⅧInVitroMediatedbyLentiviralVectorAbstractThestudyaindeletedcaninefactor(BDDcFⅧ)gene,andtoinvestigateotorstocreatelentiviralvectorspTK161andpTK162.MeantimelentiviralvectorspTK161′andpTK162′otorsrespectively.Vectorsupernatantphosphatemediatedcotransfectionof29

4、3Tcells.Thevirusvector,ΔNRFpackagingplasmid,andVSVGenvelopeplasmideanalyzing.Theresultssholand2.83×106U/ml;theactivityofcFⅧcouldbedetectedat24hoursafterinfectionof293TcellsbypTK161andpTK162,andachievedthehighestlevelat72hourslater.ThehigherlevelofcFⅧactivityaldogplasma.1/4ofthehighestlevelcouldb

5、edetected6ophiliaA.KeyophiliaA；genetherapy血友病A是凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因缺陷导致凝血因子Ⅷ缺乏的X隐性连锁的出血性疾病。目前该病的治疗方法主要是输注血浆源性FⅧ制品或基因重组FⅧ产品，这种蛋白替代疗法疗效肯定，但存在费用昂贵、血源性病毒感染、反复输注会产生抑制性抗体等许多棘手的问题［1-3］。由于血友病A是一种单基因遗传病，基因治疗可望成为一种有效治疗手段［4］。本研究分别构建了含有PUB启动子和2OH1启动子cFⅧ的慢病毒表达载体pTK161和pTK162，采用三质粒包装系统，检测感染细胞上清中的cFⅧ活性，为血友病A慢病毒载体介导基因治疗寻求有

6、价值的实验依据。主要试剂各种工具酶、1kbDNALadder、质粒小量提取试剂盒PlusSVMiniprepsDNAPurificationSysterm、目的基因纯化试剂盒PCRDNAPurificationSystem、线性化载体纯化试剂盒DNACleanUpSystem均购自Promega公司，凝血因子FⅧ活性检测试剂盒Coamatic○RFactorⅧ购自Chromogenix公司。质粒、菌种、包装细胞慢病毒载体pTK151（含有PUB启动子）、慢病毒载体pTK152（含有2OH1启动子）由本室构建，pBKCMV（含B区缺失型FⅧcDNA，BDDFⅧcDNA）由北卡大学基因治疗中

7、心晁恒军博士惠赠，包装质粒ΔNRF、包膜质粒VSVG、感受态大肠杆菌、包装细胞293T等均由本室制备或保存。载体的构建及鉴定用XbaI和EcoRV双酶切pBKCMV，得到4400bp的BDDFⅧcDNA片段,用低熔点凝胶进行电泳，PCRDNAPurificationSystem纯化后作为插入片段。用XbaI和HpaI双酶切pTK151，与纯化后的BDDFⅧcDNA片段进行连接反应，连接后的载体用BamHⅠ