去铁胺激活半胱天冬酶3诱导hl

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1、去铁胺激活半胱天冬酶3诱导HL【摘要】为了研究铁螯合剂—去铁胺（deferoxamine，DFO）诱导人白血病细胞株HL-60凋亡时半胱天冬酶-3（caspase-3）活性的变化并探讨DFO诱导凋亡的可能机制。HL-60细胞经HE染色，在光学显微镜下观察其形态结构变化，用TUNEL法和流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡，免疫组织化学法检测caspase-3活性，原位杂交法检测凋亡基因bax的转录水平。结果表明，HL-60经去铁胺处理后，典型的细胞形态改变、DNA末端原位标记和FCM检测均证实DFO可诱导细胞凋亡，凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。在DFO诱导HL-60凋亡过程中，

2、caspase-3活性明显升高，凋亡基因bax的转录水平均较对照组增高（P<0.05）。caspase广谱抑制剂Z-AVD可明显降低DFO诱导的细胞凋亡率。结论：DFO通过激活caspase-3和增强bax活性而诱导HL-60凋亡。【关键词】细胞凋亡　　DeferoxamineInducesApoptosisofHL-60CellsbyActivatingCaspase-3　　AbstractThisstudyine)，andtoexplorethemechanismunderlyingapoptosisinHL-60cells.TheHL-60cellstreatedin

3、edbylightmicroscopy，floetry(FCM)andDNAagarosegelelectrophoresis;theactivityofcaspase-3inedbycellularimmunohistochemistry;thetranscriptionoftheapoptoticgeneofbaxorphologicalcharacterofapoptosiscells，DNAladderandFCMassayconfirmedthatDFOcouldinducetheapoptosisinHL-60cells.Theapoptoticrateincreas

4、edindose-andtime-dependentmanner.I1640培养液为美国Gibco公司产品；精制小牛血清为美国Hyclon公司产品；噻唑兰（MTT）为美国Sigma公司产品；原位细胞凋亡检测试剂盒为德国BoehringerMannhEim公司产品；膜联蛋白Ⅴ（AnnexinV）检测试剂盒为深圳晶美公司产品；Bax原位杂交试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品；　　流式细胞仪（FACScan，）购自美国BectenDickinson公司。　　细胞培养及分组　　HL-60细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中常规传代培养。收集对数生长期细胞进行实验，试验组

5、分别加入10、50、100μmol/LDFO共培养，对照组加生理盐水。　　细胞形态观察　　收集经药物作用后的细胞，涂片凉干，HE染色，油镜下观察。　　　流式细胞术检测　　收集1×106个细胞，PBS洗3次，重悬于500μl缓冲液，加入5μlAnnexinV-FITC及5μlPI，混匀，室温避光15分钟，PBS洗后，流式细胞仪检测。　　DNA琼脂糖凝胶电泳　　经0、50、100μmol/LDFO作用48小时后，每样品收集1×106个细胞，酚－氯仿常规抽提DNA，取样加入1.5％琼脂糖凝胶电泳1-2小时，0.5μg/ml溴乙啶溶液染色后，紫外灯下观察结果并拍照。　　细胞免疫组织化学法

6、检测胞内半胱天冬酶3活性　　收集细胞涂片、固定，滴加1∶150稀释的一抗，洗涤3次，滴加二抗和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，DAB-底物显色，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。随机记数300个细胞，计算阳性率，阳性率＝阳性细胞数/300×100%。　　原位杂交法检测baxRNA　　收集细胞涂片、固定，3％H2O2/甲醇孵育30分钟，滴加预杂交液恒温40℃孵育3小时，滴加含寡核苷酸探针原位杂交液恒温38℃孵育过夜，滴加生物素化鼠抗地高辛，DAB显色。细胞阳性率计算方法同上。　　统计学处理　　实验数据均以均数±标准差（X±D）表示，采用t检验。　　结果　　细胞形态学改变　　收集细胞涂片、

7、凉干，HE染色后光镜下可见细胞胞膜皱缩，染色质凝集、边缘化，胞质起泡，甚至有凋亡小体形成。而对照组细胞大小均匀，形态正常。　　DFO浓度和作用时间与细胞凋亡的关系　　10、50和100μmol/LDFO分别作用于HL-60细胞24、48和72小时，随着作用时间的延长，凋亡率也随之增加，表明DFO呈剂量和时间依赖性地诱导细胞凋亡（表1）。各组与对照组相比均有显著性差异（P<0.05）。Table.Effectsoftheactingtimeandconcentrationof