组蛋白去乙酰化酶抑制剂saha阻断mapk 信号通路并诱导hl60细胞凋亡

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1、组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA阻断MAPK信号通路并诱导HL60细胞凋亡作者：王颖　王生余　侯春梅　徐元基　杜芝燕　于晓妉【摘要】　　本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂－SAHA（suberoylanilidehydroxamicacid）诱导人急性髓性白血病细胞株HL60凋亡的分子机制。采用MTT法，瑞氏姬姆萨染色和Hoechst33342／PI荧光染色方法，检测SAHA对HL60细胞生长的抑制作用及细胞的形态变化；通过流式细胞术、APK及PI3K/Akt检测结果表明，涉及MAPK信号通路的Raf及ERK激酶磷酸化受到明显抑制，而Akt及其下游mTO

2、R激酶的活性没有明显改变。结论：SAHA对HL60细胞的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现，与细胞增殖相关的P44/42MAPK信号通路被阻断是细胞凋亡发生的机制之一。【关键词】组蛋白去乙酰化酶抑制剂；SAHA；MAPK；信号转导；细胞凋亡；HL60细胞　　HistoneDeacetylaseInhibitorSAHAInducesInactivationofMAPKSignalingandApoptosisinHL60CellsAbstractThestudyedtoinvestigatethemolecularmechanismsofhistonede

3、acetylaseinhibitorSAHAinducedapoptosisofacutemyeloidleukemiacelllineHL60.TheeffectofSAHAonHL60cellproliferationorphologicalchangessaandHoechst33342staining.ThecellcycledistributioninedbyfloetryandtheexpressionofcellsignalingprotEinsedependentmanners，after2μmol/LSAHAexposurefor12-

4、48hours,thecellcycleedbyEItherdefinedapoptoticbodiesstainedbyHoechst33342,APKsignalingpathicacid）是继HMBA(hexamethylenebisacetamide)之后的第二代羟肟酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histondeacetylaseinhibitor,HDACi）。与HMBA相比,它诱导鼠红白血病(murineerythroleukemia,MEL)细胞分化的活性是HMBA的2000倍，并且在微摩尔(μmol/L)水平即可达到如此高的活性［1］。已知组蛋白

5、的乙酰化状态可以影响基因的表达，当组蛋白处于乙酰化状态时，由组蛋白与DNA双链构成的核小体结构变得更为开放，有利于各种转录因子与DNA的结合，启动基因的表达。而当组蛋白处于低乙酰化状态时，可出现转录抑制，并介导肿瘤的发生，因此HDACi已经成为一类新型的抗肿瘤制剂。目前，SAHA已经在美国进入Ⅱ期临床试验。研究表明，SAHA可以选择性诱导细胞周期负调控子p21的表达，从而阻滞细胞周期［2］，同时可以诱导多种肿瘤细胞的分化和凋亡，但其诱导细胞凋亡的分子机制还不十分清楚。本研究采用HL60细胞为研究模型，探讨SAHA诱导其凋亡的分子机制。材料和方法细胞系及培养条件

6、急性髓性白血病细胞HL60为本室冻存保存株，用含10％灭活胎牛血清及青霉素、链霉素（各100U／ml）、NaHCO3(2g/L)、HEPES(2.4g/L)的RPMI1640(GibcoBRL)培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。定期换液传代，取对数生长期细胞用于实验。试剂SAHA（suberoylanilidehydroxamicacid）由英国阿斯利康公司提供。MTT（methylthiazolyltetrazolium）购自Sigma公司,500mg粉末溶于100mlPBS中，过滤分装，-20℃避光保存。抗体acetyleH3、PARP、p

7、Akt、Akt、pmTOR、mTOR、pRaf、pErk、Erk均购自CellSignalingTechnology公司。抗CDK4、Raf1抗体购自BectonDickinsonPharMingen公司。抗p21抗体购自SantaCruzBiotechnology公司。抗βactin抗体购自Oncogene公司。ECL试剂，BCA试剂盒购自PIERCEBiotechnology公司，Laemmlisamplebuffer购自BioRad公司。细胞生长曲线测定采用台盼蓝排斥实验。将对数生长期HL60细胞以2×104／ml浓度接种于6孔板，设正常对

8、照组及SAHA终浓度为1