组蛋白去乙酰化酶抑制剂对前列腺癌pc3细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

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1、组蛋白去乙酰化酶抑制剂对前列腺癌PC3细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用【摘要】目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对前列腺癌PC3细胞株的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法前列腺癌PC3细胞经不同剂量组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用后，MTT法测定组蛋白去乙酰化酶抑制剂对PC3细胞的增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡峰，荧光分光光度计测定caspase3的活性。结果组蛋白去乙酰化酶抑制剂对PC3细胞有显著的增殖抑制作用，呈时间剂量依赖性;细胞周期被阻滞于G1/G0期，S期细胞减少;组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用后加药组caspase3表达增加，与对照组比较有显著差异(P<0.01)

2、。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂对PC3细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用。【关键词】组蛋白去乙酰化酶抑制剂;前列腺癌细胞株PC3;细胞凋亡组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一，与癌症的发生密切相关。近年研究表明，染色体组蛋白乙酰化水平的变化与细胞周期进程的变化密切相关〔1〕。人们发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)可以使细胞周期停滞在G1和G2期〔2〕。曲古抑菌素(trichostatinA，TSA)是一种氧肟酸类HDAC抑制剂，为一种抗真菌类药物，能抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性，这一类HDAC抑制剂被证明可在小剂量、低浓度情况下导致肿瘤分化，并选择性

3、地抑制肿瘤生长而对正常细胞无毒副作用〔3〕。本研究通过选用不同浓度的TSA作用于前列腺癌PC3细胞株，旨在探讨TSA对人前列腺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，并初步分析其作用机制。　　1材料与方法　　1.1主要试剂TSA购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)稀释成工作液，等量分装，置于-20℃保存，用前解冻。胎牛血清、RPMI1640、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMSO、胰蛋白酶均购于为北京华美公司;碘化丙啶(PI)、caspase3检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。　　1.2细胞系及细胞培养前列腺癌PC3细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所，置于37℃、饱和

4、湿度的5%CO2培养箱中开放培养，培养用RPMI1640培养液(含10%小牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100mg/L)。细胞呈单层贴壁生长，达80%左右融合时用0.25%的胰蛋白酶消化传代，每2～3d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。　　1.3细胞增殖抑制实验(MTT法)取对数生长期的PC3细胞按1×104/L接种于96孔细胞培养板中,每孔200μl，实验组分别加人不同浓度的TSA20μl(终浓度分别为10、50、250、1250nmol/L)，对照组加入与TSA等量的培养液20μl，每组设3个平行孔。置于37℃、5%CO2培养箱内培养，分别于第1、2天进行处理，每孔加

5、人20μlMTT液(5g/L，以PBS缓冲液配制)，继续培养4h后，弃上清，每孔再加入DMSO150μl，震荡10min，用酶标仪于492nm波长下测定每孔的吸光度(A)值。计算公式：抑制率(%)=(1-A对照/A实验)×100%。　　1.4流式细胞仪检测凋亡及细胞周期分析取对数生长期的PC3细胞按1×106/L接种于6孔细胞培养板中，实验组加入终浓度为750nmol/L的TSA，对照组加入与TSA等量的培养液，作用24h后，无菌收集细胞〔数目约(1～5)×106个/ml〕1200r/min离心5min，弃去培养液，加人PBS洗涤细胞2次，然后用预冷的无水乙醇(乙醇终浓度为70%

6、)固定，4℃过夜后再用PBS洗2次以去掉固定液，加入PI综合染液1ml(50μg/mlPI，20μg/mlRNase，0.1%TritonX100)，至4℃避光30min后上机检测，每组重复3次。　　1.5Caspase3活性检测取对数生长期的PC3细胞,实验组加入终浓度为750nmol/L的TSA，对照组加人与TSA等量的培养液，作用24h后，胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600r/min4℃离心5min收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤1次。同前吸尽上清后，按照每2×106细胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴

7、裂解15min，立即测定caspase3的酶活性。　　1.6统计学处理使用SPSS10.0统狡软件。计数资料和率的比较采用χ2检验。　　2结果　　2.1不同浓度TSA对PC3细胞的抑制作用10、50、250、1250nmol/LTSA处理PC3细胞24h后,随浓度增加，吸光度逐渐降低，当浓度>250nmol/L时，与对照组比较有显著差异(P<0.001)(见表1)。细胞存活率分别为80%、75%、62%、49%，与上述结果一致。表1曲古抑菌素对PC