组蛋白去乙酰化酶抑制剂对脑缺血保护作用的机制研究

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1、组蛋白去乙酰化酶抑制剂对脑缺血保护作用的机制研究目的：本研光分别采用体外缺氣/缺糖(oxygen-glucosedeprivation，OGD)损伤和体内小鼠短暂性大脑中动脉缺血(transientmiddlecerebralocclusion,tMCAO)再灌注损伤两种模型，初步探W纟11蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedcacctylascinhibitor,HDACi)对缺血性脑卒屮的保护作用及其相关保护机制，为临床应用HDACi治疗脑缺血性疾病奠定理论慕础。方法：1、采用化学方法建立SH-SY5Y细胞

2、不同时间持续性OGD损伤模型，MTT法检测细胞活性，以评佔持续性OGD损伤对SH-SY5Y细胞的损伤程度。继而观察HDACi对OGD诱导的神经元损伤的影响，实验指标如下：倒置显微镜观察细胞形态学变化，MTT检测HDACi对细胞活性的影响，Propidiumiodide(PI)和Hocchst33258染色检测细胞凋亡与坏死情况，乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤，荧光显微镜检测各组细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)含量和线粒体膜电位(mitochondrionmembranepot

3、ential,MMP)的变化，Westernblot检测各组细胞乙酰化水平的变化。2、健康雄性Balb/c小鼠随机分力2组:伪手术(Sham)组、I/R组。I/R组按照Zea-Longa线栓法逮立小氣左侧大脑中动脉缺血30min后再灌注损伤模型。Sham组的手术操作步骤同I/R组，但是不进行大脑中动脉栓塞。I/R组分为三个亚组：I/R24h组、I/R48h组、I/R72h组。于再灌注24h后进行神经功能缺陷评分，之后处死取材，分别进行TTC染色测量脑梗死体积。3、健康雄性Balb/c小鼠随机分为4组：Sham组、

4、I/R组、SAHA组、溶剂对照组(DMSO)。I/R组按照改良Zea-Longa线栓法建立小鼠左侧大脑中动脉缺血30min后再灌注48h损伤模型。Sham组的手术操作步骤同I/R组，但是不进行大脑中动脉栓塞。SAHA组分为三个亚组，分别在大脑中动脉栓塞成功后立即腹腔注射不同齐IJ量的SAHA:SAHA1组-注射SAHA12.5mg/Kg;SAHA2组-注射SAHA25mg/Kg；SAHA3组-注射SAHA50mg/Kg。DMSO组：大脑中动脉栓塞成功后立即腹腔注射l%DMS01ml。于再灌注24h后进行神经功能缺

5、陷评分，再灌注48h后处死取材，分别进行TTC染色测量脑梗死体积以及Westernblot检测脑组织蛋白的乙酰化水平变化情况。结果：1、OGD损伤2h，模型组的细胞活性和乙酰化水平较对照组显著降低，并随OGD时间的延长而变化越显著。MMP水平较对照组显著降低，而ROS含:W:较对照组显著升尚,Hoechst和PI双染检测也发现染色质凝聚，核碎裂，凋亡小体产生，并随OGD时间的延长，凋亡和坏死细胞的数量增加。与模型组相比，TSA和SAHA均能明显提高OGD诱导的神经元损伤的活性，改善细胞形态。此外，O.SgmoLl

6、/SAHA可明敁减少OGD引起的神经元凋亡和坏死数量，减轻细胞LDH释放，降低细胞闪ROS含量，以及提高MMP和乙酰化水平。2、神经功能缺陷评分显示，与Sham组相比较，I/R组出现程度不同的神经生物学缺陷，神经功能缺陷评分为(2.60±0.15)分，Sham组无神经功能缺陷。TTC染色显示缺血再灌注组小鼠有明显的梗死灶，Sham组则无，差异有统计学意义。3、祌经功能缺陷评分和脑梗死体积：与Sham组相比较，SAHA组和I/R组均出现不同程度的神经生物学缺陷，神经功能缺陷评分在1-3分之间，Sham组无神经功能缺

7、陷。与DMSO组相比较，SAHA12.5mg/Kg组无明S改善小鼠的祌经功能缺损评分，与I/R组无明显差异。虽然脑梗死体积有所减少，但差异无统计学意义。SAHA25mg/Kg和50mg/Kg组均可降低神经功能缺陷评分，显著减少脑梗死体积，与I/R组相比较，分别减少脑梗死体积42.92%和56.53%。SAHA25mg/Kg组和50mg/Kg组比较无显著差异。Westernblot结果显示，与Sham组相比较，1/R组小鼠缺血侧大脑的乙酰化水平显著下降。SAHA在腹腔注射6h可显著升高正常小鼠脑蛋白的乙酰化水平(p

8、<0.05),24h后与Control组无显著差异。SAHA25mg/Kg和50mg/Kg可显著抑制脑缺血诱导的乙酰化水平下降。结论：1、HDACi对OGD诱导SH-SY5Y细胞缺氧/缺糖损伤具有明显的保护作用，其保护机制可能与降低细胞内ROS水平及维持MMP的高能状态有关。2、改良线栓法是一种简单、可靠的制作小鼠短暂性MCAO模型的方法，MCAO30min再灌注48h可