反相高效液相色谱法测定全血中环孢素a的浓度

《反相高效液相色谱法测定全血中环孢素a的浓度》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、反相高效液相色谱法测定全血中环孢素A的浓度作者：张卫东，王国团，朱春梅【关键词】反相高效液相色谱法;环孢素A;血药浓度监测　　［摘要］目的:建立检测患者全血中环孢素A（CsA）浓度的高效液相色谱法。方法:血样经乙醚-石油醚（70∶30）萃取后，以C18硅胶键合相为固定相，乙腈-甲醇（80∶20）为流动相，70℃柱温下进行色谱分析，紫外检测波长为210nm。结果:CsA全血浓度在50～1600ng.mL范围内呈良好的线性关系，r=0.9998，方法的平均回收率为97.6%，日内和日间精密度RSD均小于6%（n=5），最低检测限为10ng.mL。结论:本法简便、快速，易于开展，用于肾移植术后患者

2、CsA的血药浓度监测，效果良好。　　［关键词］反相高效液相色谱法;环孢素A;血药浓度监测DeterminationofcyclosporinAinhumannandamobilephaseofacetonitrile-methanol（80∶20）.Thecolumntemperatureaintainedat70℃andCsA.Results:Agoodlinearrelationship50ng.mLto1600ng.mL，r=0.9998.TheaveragerecoveryrateofCsAitofCsAL.Conclusions:Theestablishedmethodple，se

3、nsitiveandsuitableforthetherapeuticmonitoringofCsA.［Keyonitoring环孢素A（CyclosporinA，CsA）是一种选择性的免疫抑制剂，广泛用于器官移植疾病及其它疾病治疗［1，2］。由于CsA体内过程的个体差异较大，其血药浓度过高或过低都会引起毒副反应，因此在患者治疗过程中需常规监测血药浓度，从而提高移植器官或组织的存活率并降低对肾脏和肝脏的毒副作用［3］。目前国内外测定全血中CsA的方法主要有荧光偏振免疫法（FPIA）和高效液相色谱法。FPIA法因简便、快速而受到临床欢迎，但其测定成本昂贵，且该法易受代谢产物等因素的干扰，使测定

4、结果偏高;HPLC法有固相萃取法和液-液多步萃取法［4、5］，操作较繁琐，但成本较低。为此，本文建立了一种简便可行的RP-HPLC法测定CsA全血浓度，用于肾移植术后患者CsA血药浓度监测，效果良好。　　1材料和方法　　1.1仪器高效液相色谱仪（美国apure，20050318、20050116），其他试剂为分析纯。　　1.3标准溶液的配制精密称取CsA标准品8mg，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶（80μg.ml）得贮备液，保存于-20℃冰箱中。精密称取CsD标准品5mg，用甲醇定容至100mL容量瓶中，配制成贮备液，取CsD储备液4mL用甲醇稀释至100mL容量瓶，配制成2000ng.

5、mL的内标工作液。1.4色谱条件固定相:Nova-PakC18柱（4μm，3.9mm×150mm）（美国L.min;检测波长:210nm;灵敏度:0.005AUFS。　　1.5样品处理0.5mL血样中加100μL内标工作液，旋涡混匀后，加入150μL250mmol.L的氢氧化钠液，旋涡混匀后置45～50℃水浴孵育约5min破坏RBC，再混匀后，加3mL石油醚-乙醚（70∶30），旋涡提取8min，3000r.min离心3min，分离有机层于尖底试管，于45～50℃水浴通氮气吹干，再加300μL甲醇溶解后，分别用1mL正己烷-正庚烷（50∶50）反萃取两次后，1500r.min离心3min后吸

6、弃上层液，于45～50℃水浴通氮气吹干，残渣用50μL甲醇充分溶解，按“色谱条件”项下条件进样20μL分析。2结果2.1方法可行性在所选色谱条件下，CsA及内标CsD能较好的分离（CsA、CsD的保留时间分别为7.25min、9.30min），分离度R=1.602，色谱峰与内源性杂峰分离良好，易准确定量。色谱图见图1。A:空白血样B:空白血样+CsAC:空白血样+内标D:空白血样+CsA+内标E:患者血样图1血液中环孢素A的HPLC图（1-CsA2-内标）　　2.2标准曲线的绘制取空白全血加入CsA标准溶液，配制成相当于血中CsA浓度分别为50、100、200、400、800、1600ng.

7、mL的样品，按“样品处理”项下操作，进样测定，内标法定量，以CsA峰高与内标峰高比值（Y）对浓度C进行线性回归，CsA在50～1600ng.mL浓度范围内线性方程为:Y=0.0030C+0.0046，r=0.9998，表明线性关系良好。本法最低检测限为10ng.mL（按信噪比3∶1计）。　　2.3回收率、精密度试验取空白全血分别加入CsA标准溶液，使其浓度分别为100、300、600ng.mL，按“样品处理”