雷公藤多甙对类风湿关节炎患者滑膜细胞凋亡的影响

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1、雷公藤多甙对类风湿关节炎患者滑膜细胞凋亡的影响作者：周光伟沈权金若珏王晓东曾云祥叶澄宇【摘要】目的观察雷公藤多甙(TripterygiumGlycosides,TG)对类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)患者滑膜细胞凋亡的影响，以揭示TG治疗RA可能的作用机制。方法体外培养RA患者滑膜细胞，加入不同浓度的TG，24h光镜观察其凋亡的形态学特征，并用流式细胞仪及TUNEL法检测滑膜细胞的凋亡。结果TG组凋亡细胞百分率(55±11.2)%，显著高于骨折（NC）组（P<0.01）。结论TG可诱导滑膜细胞凋亡，这可能是其治疗RA的作用机制之一。【关键

2、词】类风湿关节炎滑膜雷公藤多甙凋亡资助项目：温州市鹿城区科学技术局资助项目(S040210)　　【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectsoftripterygiumglycosides(TG)onsynoviocyte'sapoptosisofrheumatoidarthritis(RA),inordertoexplorethepossiblemechanismofTGintreatingRA.MethodsSynoviocytefromRApatientsorphologicalcharactorsofsynoviocyte'sapo

3、ptosisicroscope24hourslater,floetryandTUNELaybeoneofitsmechanismfortreatingRA.　　【KeyatoidarthritisSynoviumTripterygiumglycosidesApoptosis　　类风湿关节炎（rheumatoidarthritis,RA）是一种以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性自身免疫性疾病,发病机制尚未完全明确。FirestEin等［１］认为可能是滑膜细胞凋亡机制障碍所导致的滑膜组织内细胞的增殖和死亡之间平衡失调而引起。雷公藤多甙（TripterygiumGl

4、ycosides,TG）是一种具有多种免疫调节作用的中药制剂，对RA有一定的疗效，但其作用机制尚不明确［２］。最近的研究表明，雷公藤能诱导多种细胞凋亡，但是否能诱导滑膜细胞凋亡,以及其抑制滑膜细胞增生是否和细胞凋亡有关尚未见有报道。本文对TG诱导滑膜细胞凋亡进行研究，旨在探讨其可能的药理机制。　　1对象与方法　　1.1病例选择　　2004年9月至2005年11月本院住院的RA患者7例，其中男4例，女3例，年龄32～55岁，平均(40±2.3)岁；病程5～17年，平均(6.4±2.1)年。RA的诊断符合美国风湿病协会1997年制定的标准，并经术后病理检查确诊。另选７例骨折（

5、NC）患者作为对照。　　1.2滑膜细胞的分离和培养　　从膝关节滑膜切除术或关节置换术获得的滑膜组织剪成1mm2大小的碎块，加入0.05%Ⅰ型胶原酶消化3.5h，然后置于37℃的5%CO2培养箱中孵育24h，倒去未贴壁的细胞，剩余贴壁细胞继续培养，在100ml内加10%小牛血清，在100U/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养液（NY)瓶中继续培养，每3～4d换液1次。用于实验的细胞均为3～10代之传代细胞，为成纤维细胞样滑膜细胞［３］。　　1.3TG诱导滑膜细胞凋亡　　将对数生长期RA、NC患者的滑膜细胞调整为5×105/ml，并各分为4瓶，同时加入TG（新昌第二

6、制药厂），调整加入量使TG浓度分别为5、10、20、30mg/L，放回37℃的5%CO2培养箱中继续培养，于加药后12、24、48、72h观察形态变化并进行相应实验。　　1.4凋亡形态学观察　　定时将加药后的培养瓶取出，直接置于倒置显微镜下观察并摄相，观察结束后继续放回孵箱中，待下次观察。　　1.5流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡　　收集适量细胞，PBS洗2次，加入70%乙醇固定30min，离心后PBS洗2次，弃上清液，保留0.5ml液体，将细胞吹打开，加入RNA酶（终浓度为45mg/L)，37℃，45min，再加碘化丙啶（PI，终浓度为50μg/mL），4℃避光，染色1h。用

7、流式细胞仪检测滑膜细胞的凋亡，激发波长为488nm，计数10000个细胞；用FACScan软件进行数据分析，并给出散点图。　　1.6TUNEL法检测滑膜细胞凋亡　　按说明书操作，将细胞涂片用4%多聚甲醛固定，室温30min，与0.3%H2O2甲醇阻断剂室温孵育30min，与0.1%TritonX-100通透液在冰浴中孵育2min，滴加50μlTUNEL反应混合液，湿盒孵育60min，再加入50μl转化剂-过氧化物酶（POD），37℃孵育30min，最后加入3',3'-二氨基联苯胺(DAB)底物溶液，在光镜下观察结果。　　1.7