丹参诱导类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞凋亡

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1、丹参诱导类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞凋亡：刘青松，凡瞿明，蒋红，朱兴春，邢艳，唐中【摘要】目的探讨丹参对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞凋亡的影响。方法类风湿关节炎患者关节滑液经原代培养，应用3～5代传代的成纤维样滑膜细胞，分为3组，分别为高剂量丹参组(丹参终浓度为50mg/mL)、低剂量丹参组(丹参终浓度为0.39mg/mL)和溶剂对照组，采用流式细胞术结合AnnexinV/FITC和PI双标记染色检测细胞凋亡率。结果与对照组比较，高剂量丹参组和低剂量丹参组细胞凋亡率均较对照组明显增加(P<0.05)，并且高剂量丹参组细胞凋亡率明显大于低剂量丹参组(P<

2、;0.05)。结论丹参能有效诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡。【关键词】丹参;类风湿关节炎;成纤维样滑膜细胞;凋亡　ABSTRACT:ObjectiveToexploretheeffectofsalviamiltiorrhizaontheapoptosisoffibroblast-likesynoviosytes(FLSs)frompatientsatoidarthritis(RA).MethodsFLSsRApatientsbyprimaryculturejointsynovialfluidandthrough3-5passages.Aftertreatedilt

3、iorrhizafor24h,cellsiltiorrhizasfinalconcentrationof50mg/mL),loiltiorrhizasfinalconcentrationof0.39mg/mL)andsolventgroup.TheapoptosisofRAFLSsetry(FCM).Resultsparediltiorrhizailtiorrhizacaneffectivelyinducetheapoptosisoffibroblast-likesynoviosytesfromrheumatoidarthritispatients.　　KEYEM培

4、养基(GibcoBRL公司);胎牛血清(HyClone北京生物化学制品有限公司);胰酶;AnnexinV/PI凋亡试剂盒(ABGAB，美国);注射用丹参[冻干](哈药集团中药二厂，成分为丹参，生产批号：090313);流式细胞仪(BectonDickinson);倒置显微镜(OLYMPUSIX71)。　　1.2方法　　1.2.1滑膜细胞的分离与培养采用滑液中的游离滑膜细胞进行培养。患者在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，在4℃，1000r/min离心10min，去上清后用无菌冷PBS10mL悬浮细胞，经100目尼龙网过滤去除凝块沉渣，细胞再用冷PBS洗2次后，悬浮于

5、DMEM培养液(含100mL/L胎牛血清，1×105u/L青霉素和100mg/L链霉素)，混匀后取10μL行台盼蓝染色，活细胞计数。将收集到的细胞接种于培养皿，置50mL/LCO2自动控制培养箱，于37℃培养12h后更换培养液，去除非贴壁细胞，重复2～3次，至倒置显微镜下观察，细胞呈梭状成纤维样细胞(图1A)。用胰蛋白酶法收集滑膜细胞，按细胞密度5×105/L复种于25cm2塑料培养瓶中。所有用于FCM检测的细胞为3～5代生长稳定的成纤维样滑膜细胞。　　1.2.2分组根据前期研究发现丹参终浓度为50mg/mL时TNF-α表达显著降低，且当丹参终浓度为0.39mg/mL时

6、细胞形态开始出现改变。因此，将每一病例细胞分为高剂量丹参组、低剂量丹参组和对照组(丹参终浓度为50、0.39、0mg/mL)。　　1.2.3细胞形态学观察将丹参处理前后的细胞直接置于倒置显微镜下观察，比较丹参处理前后的细胞数量、形态、大小以及细胞核形态的特点。　　1.2.4流式细胞术分析细胞凋亡采用流式细胞术(floetry,FCM)结合AnnexinV/FITC和PI双标记染色检测细胞凋亡率。待培养瓶细胞融合后(48～96h)，分别加入浓度为50、0.39和0mg/mL丹参注射液并继续培养24h。用2.5g/L的胰酶(不含EDTA)消化1min左右，收集细胞，用冷PB

7、S洗涤2次。按照AnnexinV/FITC试剂说明书操作，主要步骤如下：配制1×bindingbuffer，并用此buffer重悬细胞。按照约1×106细胞加5μLFITC，室温避光孵育15min后，再加10μLPI继续孵育5min，随即进行FCM分析。　　1.2.5统计学处理细胞凋亡率以均数±标准差(±s)表示，以丹参浓度为0mg/mL作为对照，采用SPSS10.0作OnewayANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1滑膜细胞的形态学改变经过反复贴壁与传代后，3～5代滑膜细胞逐渐纯化，主要以成纤维样细胞