weak诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成mmps及其相关机制的实验分析

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1、·中文论著摘要·TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMPs及其相关机制的实验研究目的类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病，其特征性病理改变表现为滑膜组织异常增生，炎性细胞浸润，血管翳形成，最终侵蚀关节软骨和骨，导致关节破坏。其病因及发病机制尚未完全明确。近年研究证实，基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)在RA关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用。肿瘤坏死因子样凋亡的微弱诱导剂(tumornecrosisfacto

2、r．1ikeweakinducerofapoptosis，TWEAK)是肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)配体超家族的新成员，具有广泛的生物学活性。作为一个多效性细胞因子，TWEAK在RA的发生、发展中所起的核心作用备受关注。本研究首先通过观察TWEAK在不同浓度下对RAFLS诱导合成MMPs的影响，探讨TWEAK参与RA关节骨及软骨破坏的相关机制。TWEAK是通过与其受体相互结合而发挥生物学功能的。TweakR／Fnl4是与4种不同的TRAF家族成员相关联的功能性TWEAK受体。研究发现TweakR／Fnl4

3、位于质膜，是一种在细胞．基质相互作用中发挥作用的跨膜分子。本实验通过研究TWEAKR／Fnl4在RAFLS的表达，以及影响TWEAKR／Fnl4在RAFLS表达的因素，进一步探讨TWEAK发挥其生物学功能的具体机制。TWEAK与RAFLS表面相应的受体结合以后，激活特定的信号转导通路才能发挥其多种生物学效应。p38蛋白激酶是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一。p38激酶在RA发病中的作用日益受到人们的重视。目前，关于TWEAK处理后的RAFLS能够激活哪蝗信号转导分子，国内外的研究尚无定论。本实验着重探讨P38MAPK信号通路在TW

4、EAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成IV[M'P$过程中的作用，试图揭示TWEAK诱导RAFLS活化及导致关节炎性破坏的相关机制，为RA治疗寻求新的靶点。实验方法1、类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的原代培养：在无菌条件下取得新鲜的RA滑膜组织，胶原酶消化法分离纯化滑膜成纤维细胞，实验用3～7代细胞。2、取处于对数生长期的FLS，调整细胞浓度，接种于6孔细胞培养板，加入TWEAK、TNF—a、IL-lp、SB203580，于37℃5％C02孵箱内持续培养72h后，收集细胞培养液和细胞置．20℃备用。3、免疫组化法定位检测TWEAKR／F

5、nl4蛋白在RAFLS的表达。4、ELISA法检测细胞培养液中MMP．1、MMP．3的浓度。5、RT-PCR法检测MMP．1、MMP．3、Fnl4基因mRNA的表达。6、、Westernblotting法(免疫印迹法)测定TWEAKR／Fnl4、p-p38MAPK和p65在RAFLS的表达。馇田耋口7氐1、TWEAK诱导RAFLS合成MMP．1、MMP．3的水平高于对照组，呈明显的剂量依赖性，TWEAK终浓度为50ng／ml的实验组MMP．1、MMP．3刺激指数分别为3．233、3．218，TWEAK终浓度为100ne,／mi的实验组MM

6、P．1、MMP．3刺激指数分别为5．906、6．119，具有显著的统计学差异(火0．05)；TNF．n和IL．1B对TWEAK诱导RAFLS合成MMP．1、MMP．3具有协同作用，相同TWEAK浓度下的实验组，单纯TWEAK组与协同作用组比较，协同作用组MMP．1、MMP．3的水平明显高于单纯TWEAK组，具有显著的统计学差异(尸<0．05)：TNF—a与IL-lp对TWEAK诱导RAFLS合成MMP．1、MMP．3的协同作用，无显著的统计学差异(伶O．05)。2、TWEAK终浓度为100ng／ml诱导RAFLS的MMP．1、MMP．3m

7、RNA表达水平高于对照组，分别为对照组的1．29、1．26倍，具有显著的统计学差异(尸<0．05)；TNF-a和IL一1p对TWEAK诱导RAFLS的MMP．1、MMP．3mRNA2表达具有协同作用，单纯TWEAK组与协同作用组比较，协同作用组MMP．1、MMP．3mRNA表达水平明显高于单纯TWEAK组，具有显著的统计学差异(P<0．05)；TNF．(It与IL．1B对TWEAK诱导RAFLSMMP．1、MMP．3mRNA表达的协同作用，无显著的统计学差异(P>0．05)。3、免疫组化染色显示胞膜及胞浆内出现棕黄色颗粒状物质的细胞为TW

8、EA硒泖n14染色阳性的细胞。结果发现：对照组可见少量TWE脚娘／Fnl4染色阳性的细胞；TWEAK(终浓度为100ng／m1)存在时TWEAKR／Fnl4在RAFLS表达较对照组增多：TNF